轉化

轉化的研究不但在理論上有重要意義，而且在基因工程中是將質粒或病毒載體引入宿主細胞的一種重要手段（見重組DNA技術）。它也可能為育種和遺傳性疾病的基因治療提供新的途徑。

受體菌直接攝取供體菌的DNA片段而獲得新的遺傳性狀的過程。

轉化現象1928年英國學者F．格里菲思在肺炎雙球菌中發現的。他把不產莢膜的無毒的粗糙型肺炎雙球菌和加熱殺死後的產莢膜的有毒的光滑型肺炎雙球菌混合注射小鼠，發現小鼠意外地被感染致死，而且從小鼠的血液中分離出活的產莢膜的肺炎雙球菌。不久又發現產莢膜細菌的無細胞抽提物同樣能在試管中使不產莢膜的細菌變為產莢膜的細菌。1944年美國細菌學家O．T．埃弗里等從元素分析、酶學分析、血清學分析以及生物活性鑒定等方面證實了無細胞抽提物中引起肺炎雙球菌莢膜轉化的轉化因子是脫氧核糖核酸（DNA），第一次為遺傳物質是DNA而不是蛋白質提供了直接的證據。到目前為止，已經在流感嗜血桿菌（Hemophilus influenzae）、鏈球菌（Streptococcus）、沙門氏菌（Salmonella）、奈瑟氏菌（Ne－isseria）、根瘤菌（Rhizobium）、枯草桿菌（Bacillus subti-lis）、大腸桿菌（Escherichia coli）等幾十種細菌中報道了轉化現象，所轉化的性狀包括莢膜、抗藥性、糖發酵特性、營養要求特性等等。它們的轉化因子都是DNA。

轉化過程包括有轉化能力的染色體DNA片段的吸附、吸收和整合3個階段。外源DNA首先吸附在細菌細胞表面的一些接受位點上。肺炎雙球菌和枯草桿菌等細胞的接受位點沒有專一性，它們能吸附同種的DNA，也能吸附大腸桿菌的DNA。流感嗜血桿菌的接受位點則只能吸附近緣細菌的DNA。DNA在和細菌剛接觸時可以被洗去，在穩定吸附以後便不能洗去，但還能被核酸酶水解。DNA被細胞吸收以後便不能被外源的核酸酶水解。能吸附的DNA主要是雙鏈狀態的，在通過細胞膜進入細胞的吸收過程中DNA分子轉變為單鏈，並以這種形式整合到細菌染色體上。整合過程又可以分5個步驟。

外源基因整合后，通過基因表達使受體細菌的表型發生相應的變化。圖中所示的轉化模式至少對於肺炎雙球菌和枯草桿菌來講是正確的。

質粒DNA的轉化和染色體DNA的轉化有顯著的不同。在一般情況下前者的轉化效率遠遠低於後者。但如果先用一定濃度的鈣離子處理大腸桿菌細胞，再用質粒DNA和染色體DNA對它做轉化實驗則情況恰好相反。此外，質粒DNA很容易進入去掉了細胞壁的細菌的原生質體，說明對它的吸收並不通過專門的接受位點；質粒DNA的轉化過程沒有整合這一環節。

許多因素可以影響轉化效率。受體細菌和供體細菌的親緣關係愈遠則轉化效率愈低，這主要是受吸附位點專一性和染色體的同源程度的影響。DNA分子的聯會是供體DNA整合到受體DNA上的先決條件，聯會一般只發生在同源染色體之間，而親緣關係愈遠則同源性愈低，所以轉化效率也愈低。但細菌間染色體的某些部位如核糖體基因部位在進化過程中很少發生變化，而有些性狀如紅黴素抗性和鏈黴素抗性等都是由於與核糖體有關的基因發生突變而使核糖體蛋白結構改變的結果，所以如果所轉化的是紅黴素或鏈黴素抗性基因或者和它們緊密連鎖的其他基因，則轉化效率便較少受細菌的親緣關係的影響。

同一種細菌也可以由於基因型的改變而改變轉化效率。細菌的限制性核酸內切酶能夠分解外來的DNA，所以如果用限制酶失活的突變型菌株作為轉化受體時可以提高轉化效率。通過篩選也可以得到轉化效率顯著下降的突變型，包括吸附能力、吸收能力和整合能力下降的突變型。某些轉化效率降低的突變型對於紫外線格外敏感，這一性質也是許多喪失了DNA損傷修復能力和喪失重組功能的突變型的特性，可見轉化過程中的DNA的整合和DNA損傷修復以及基因重組都涉及某些相同的酶。

基因型完全相同的細菌可以由於生理狀態的改變而改變轉化效率。能夠吸收外源DNA的生理狀態稱為感受態。許多細菌的感受態都在對數生長期的後期迅速出現，經過一段時間以後便消失。感受態的細菌和非感受態的細菌相比，轉化效率可以高出萬倍。

從處於感受態的肺炎雙球菌和鏈球菌中曾分離出感受態因子。感受態因子是蛋白質，它能使非感受態細菌轉變為感受態，並有一定的種族特異性。

某些外界因素可以影響轉化效率，例如一定濃度的鈣離子能夠提高大腸桿菌、流感嗜血桿菌、金黃色葡萄球菌等的轉化效率。又例如流感嗜血桿菌吸收雙鏈DNA分子的最適pH是6.8， pH下降到5.5以下便不能吸收。溫度對於轉化也有影響，在肺炎雙球菌和嗜血流感桿菌中外源DNA的整合在一定範圍內都隨著溫度的上升而提高。

細菌的轉化多數是在人為條件下進行的。在自然條件下已經知道肺炎雙球菌的轉化可以在小鼠體內進行，奈瑟氏菌細胞自溶所釋放的DNA可以轉化周圍的細胞。細菌轉化的生物學意義還有待於進一步研究。在不能或不易通過細菌接合或轉導作遺傳學分析的細菌中，轉化可以作為一種研究的手段。

轉染是轉化的一種特殊形式，是用除去蛋白質外殼的病毒（包括噬菌體）核酸感染細胞或原生質體的過程。與一般的轉化過程的區別在於：①轉染過程中進入細胞的是完整的病毒DNA，而通過轉化進入受體細胞的則是染色體DNA的片斷或質粒DNA；②轉染過程中病毒DNA一般不整合到染色體上，但轉化過程則往往涉及DNA的整合；③轉染效果可用單位量的DNA引起的病斑或噬菌斑的多少來表示，轉化效果則用一定量的DNA所帶來的被轉化的受體細胞菌落數目來表示。

1. 器材

旋渦混合器，微量移液取樣器，移液器吸頭，1.5 ml 微量離心管，雙面微量離心管架，乾式恆溫氣浴（或恆溫水浴鍋），製冰機，恆溫搖床，培養皿（已鋪好固體LB-Amp），超凈工作台，酒精燈，玻璃塗棒，恆溫培養箱。

2. 試劑

培養基（不加抗菌素），LB培養基（加抗菌素），無菌ddH2O，IPTG，X-gal。

3. 材料處理

無菌ddH2O，1.5 ml 離心管裝入鋁製飯盒（滅菌）、移液器吸頭裝入相應的吸頭盒（滅菌），20%IPTG（M/V），2% X-gal（M/V，用N,N-二甲基甲醯胺配）。

1. 事先將恆溫水浴的溫度調到42℃。

2. 從-70℃ 超低溫冰櫃中取出一管（100 μl）感受態菌，立即用手指加溫融化后插入冰上，冰浴5~10 min。

3. 加入5 μl 連接好的質粒混合液（DNA含量不超過100 ng），輕輕震蕩後放置冰上20 min。

4. 輕輕搖勻后插入42℃水浴中1~2 min進行熱休克，然後迅速放回冰中，靜置3~5 min。

5. 在超凈工作台中向上述各管中分別加入500 μl LB培養基（不含抗菌素）輕輕混勻，然後固定到搖床的彈簧架上37℃震蕩1 h。

6. 在超凈工作台中取上述轉化混合液100-300 μl，分別滴到含合適抗菌素的固體LB平板培養皿中，用酒精燈燒過的玻璃塗布棒塗布均勻。

7. 如果載體和宿主菌適合藍白斑篩選的話，滴完菌液后再在平板上滴加40 μl 2% X-gal，8 μl 20% IPTG，用酒精燈燒過的玻璃塗布棒塗布均勻。

8. 在塗好的培養皿上做上標記，先放置在37℃恆溫培養箱中30~60 min 直到表面的液體都滲透到培養基里后，再倒置過來放入37℃恆溫培養箱過夜。

9. 在被細菌污染的桌面上噴灑70%乙醇，擦乾桌面，寫實驗報告。

徠10. 觀察平板上長出的菌落克隆，以菌落之間能互相分開為好。注意白色菌斑。

在酵母菌、脈孢菌和植物細胞中轉化的主要障礙是細胞壁。把細胞壁用酶消化后便能有效地轉化。高等動物細胞的轉化大多是在離體培養細胞中發現的，例如小鼠細胞、雞胚細胞和人的海拉細胞等，這些細胞常以胞飲方式攝取物質。使供體DNA形成磷酸鈣沉澱能顯著地提高轉化效率。由於高等動植物細胞的轉化頻率遠遠低於細菌，因此一個轉化實驗能否成功在很大程度上取決於選擇性培養基和選擇性標記的恰當使用。例如在一個哺乳動物細胞的轉化系統中，用取自皰疹病毒（HSV）的胸腺嘧啶核苷激酶（TK）基因DNA去轉化相應的缺陷型細胞TK-，並用HAT培養基來篩選有TK+基因標記的轉化細胞便能成功（見體細胞遺傳學）。在同一轉化系統中，如果把大量沒有選擇性標記的DNA混合少量有TK基因選擇標記的DNA去轉化TK-細胞，這樣得到的TK+細胞中將有一小部分也為無選擇性標記的DNA所轉化，這種現象稱為共轉化。

在高等動物中雖然現在還不能進行活體的轉化，但可以把轉化細胞注射到活體中，使它們取代活體中未轉化的細胞。例如可以用抗氨甲蝶吟的小鼠細胞株的DNA片段轉化體外培養的小鼠骨髓細胞（這些細胞有特定的染色體標記，易於與受體小鼠的骨髓細胞相區別），然後把轉化的骨髓細胞注入受體小鼠的骨髓。在一段時間后這些小鼠的骨髓中可以檢出抗氨甲蝶呤的細胞。如果為接受注射的小鼠經常注射氨甲蝶呤，隨著飼養時間的推移可以看到帶有特定染色體標記的細胞的百分數逐漸增加，此種情況說明抗氨甲蝶呤的細胞經過細胞分裂增殖而部分地取代了未轉化的細胞。這樣的工作顯然是向基因治療這一目標跨出的第一步。在高等植物中某些體細胞能在一定的培養條件下生長成完整的植株，因此便有可能通過轉化培養細胞培育成不同基因型的新種植株。

在真核生物的細胞生物學研究中，轉化這一名詞還有另一種意義，這就是由致癌的RNA或DNA病毒感染真核細胞引起的細胞癌變現象。進入細胞的病毒基因組DNA往往整合到被轉化的細胞的染色體上。為了明確起見，這種轉化有時又稱為細胞轉化。