轉基因動物

遺傳的基本物質是DNA，基因則是位於染色體上有遺傳效應的DNA片段，對於儲存在生物全套染色體中的全部遺傳信息，可稱其為基因組。由於不同種類、不同個體的生物基因組成是不同的，因此對動物個體來說，非自身的基因成分屬於外源基因，如果把外源基因整合或導入動物染色體基因中，那麼這個外源基因就被稱為轉基因(transgene)(即轉移來的基因)，這種動物就是轉基因動物(transgenic animals)。

轉基因動物所有的細胞均整合有外源基因，並具有將外源基因遺傳給子代的能力，若動物只有部分組織細胞整合有外源基因，則稱為嵌合體動物，這類動物只有在整合了外源基因的“部分組織細胞”恰為生殖細胞時，才能將其攜帶的外源基因遺傳給子代。

哺乳類動物基因轉移方法，是將改建后的目的基因(或基因組片段)用顯微注射等方法注入實驗動物的受精卵(或著床前的胚胎細胞)，然後將此受精卵(或著床前的胚胎細胞)再植入受體動物的輸卵管(或子宮)中，使其發育成攜帶有外源基因的轉基因動物。

根據外源基因導入的方法和對象的不同，目前製作轉基因動物的方法主要有顯微注射法、反轉錄病毒法、胚胎幹細胞(embryonic stem cell，ES細胞)法、電脈衝法、精子載體導入法等。

是最常用且成功率較高的方法，以轉基因小鼠的製作為例，大致過程如下。

一、採集受精卵

（1）超排卵：選取6～8周齡的雌性小鼠，先後腹腔注射5U孕馬血清促性腺激素(pregnant mare serum gonactotropin，PMSG)和2.5～5.0U人絨毛膜促性腺激素(humar chorionic gonactotropin，HCG)，以促進排卵，然後與鼠齡為12周～l年的雄性小鼠按1:1交配。交配成功的標誌是在雌性小鼠的陰道口發現白色的陰道栓。

（2）取受精卵：與雄性小鼠合籠的次日上午，將確認有陰道栓的雌性小鼠用頸椎脫臼法剖殺，取出輸卵管，置於培養液中，在體視顯微鏡下小心的切開輸卵管膨大的壺腹部，用透明質酸酶溶液稍用力沖洗，使受精卵與輸卵管分離，併流到培養液中，在體視顯微鏡下選擇原核清晰的受精卵，移人裝有培養液的胚胎培養皿中，然後在培養皿滴加礦物油使之覆蓋在培養液表面，在CO2孵箱(37℃，5％CO2，95％空氣)中培養5h左右(一般在上午10時左右取受精卵，培養至l3時可見雌、雄性原核，多數受精卵通常在13～18時之間原核形成並清晰可見)。

二、向受精卵雄性原核注入DNA溶液

受精卵中，有分別來自卵子和精子的兩個原核，通常來自精子的雄性原核較大，能容納更多的外源DNA，因此一般都是向雄性原核注入DNA溶液。另外，要導入的基因DNA還必須先用瓊脂糖凝膠電泳法測定其純度。將含有10～20個受精卵的培養液滴和DNA液滴共同滴放於載玻片上，然後固定在顯微注射儀的載物台上，將視野中央調於DNA液滴上，右手持充滿礦物油的玻璃吸管吸取DNA溶液，吸入量以DNA溶液和礦物油之問出現彎月形位置為準，然後再將視野中央移至

受精卵液滴上，左手控制持卵吸管，利用負壓將受精卵固定，並將右手的吸管尖端移至固定了的受精卵上，繼而插入受精卵雄性原核，將DNA溶液注人雄性原核中，為肯定是否已注入，須用肉眼確定雄性原核是否膨大。僅將未損壞的完成操作的卵收集起來，在37℃的CO2孵箱中培養過夜，第2天將發育成2細胞的卵挑選出來。

三、將2細胞的受精卵移植到假妊娠雌性小鼠的輸卵管中

用結紮了輸精管的雄性小鼠與發情期的雌性小鼠(一般選用ICR小鼠)進行交配，雖然不能引起受精，但可以刺激子宮頸管，使雌性小鼠體內的黃體活化，造成能繼續妊娠的內分泌環境，這種小鼠稱為假孕雌性小鼠。將經顯微注射的2細胞受精卵移植至交配第3天的假孕母鼠輸卵管中，仍可正常發育。操作時，最好是在兩側輸卵管各移植l2個卵，這樣，情況良好時可得8隻仔鼠，有時僅能產生1隻仔鼠，因為DNA注入而造成的損傷可使許多受精卵在中途停止發育。

四、導入基因的鑒定

通常，胚胎移植生育出的全部仔鼠中，約有20％～30％具有導入基因，因此要用Southern Blot或PCR法對導入的遺傳基因進行分析，以便挑選製作外源性基因導入成功的小鼠進行飼養和繁殖。

基因顯微注射法的特點是外源基因的導入整合效率較高，不需載體，直接轉移目的基因，目的基因的長度可達lOOkb(10萬個鹼基對)。它可直接獲得純系，所以實驗周期短。但需要貴重精密儀器，技術操作難度大，並且外源基因的整合位點和整合的拷貝數都無法控制，易造成宿主動物基因組的插入突變，引起相應的性狀改變，重則致死。

五、反轉錄病毒感染法

反轉錄病毒具有侵入宿主細胞並整合於細胞染色體DNA的能力。將外源基因DNA插入反轉錄病毒載體，通過輔助細胞包裝成高感染度的病毒顆粒，感染胚胎后，將感染的桑椹期胚胎細胞導入子宮，可發育成攜帶外源基因的子代動物。

該法整合率較高，目的基因不易破壞，多是單拷貝、單位點整合，適合於難以觀察到原核的禽類受精卵。由於病毒衣殼大小的限制，目的基因不宜超過10kb，否則影響活性和穩定。此外，病毒DNA可能影響外源基因在宿主動物的表達。

胚胎幹細胞(ES細胞)是指從囊胚期的內細胞團中分離出來的尚未分化的胚胎細胞，具有發育全能性，能進行體外培養<擴增、轉化和製作遺傳突變型等遺傳操作。本法以整合有外源基因的ES細胞作為供體細胞，大致過程如下：

(1)獲取發育至一定時期的胚胎，經培養后，剝離和分散內細胞團，再培養，最後分離、擴散、鑒定ES細胞。

(2)通過基因打靶技術，將外源基因經逆轉錄病毒感染、電脈衝法等方法導入ES細胞，體外培養和篩選有外源基因表達者。

(3)獲取囊胚期胚胎，作為ES細胞的移植受體。

(4)通過顯微操作將ES細胞注入到囊胚期胚胎的腔內，使之與內細胞團緊靠在一起，成為嵌合體。

(5)將注射過的胚胎，經培養后篩選無發育缺損的囊胚，移植到交配第3天的假孕受體動物子宮內，培育出轉基因動物。本法外源基因整合率高，植入囊胚前篩選合適的轉化的ES細胞，克服了以前只能在子代選擇的缺點，並能充分利用分子生物學發展起來的各種先進方法，是很有前途的技術。缺點是不易建立ES細胞系。並且由於通過嵌合體途徑，所以實驗周期長。

電脈衝法(electroporation)又稱電穿孔法，是將供體DNA與受體細胞充分混勻，在外界的高電壓短脈衝下改變細胞膜結構，使細胞膜產生瞬間可逆性電穿孔，從而使一定大小的DNA可以通過細胞膜進入細胞，運送到細胞核。1980年，津墨緬(Zimmermann)等首先應用電脈衝技術把藥物及染料導人小鼠胸腺細胞及紅細胞，同年汪大鍵(T.K.Wang)和細基(Neumail)首先報道了用電脈衝法將TK基因導人CTK小鼠的CTK細胞，在106個處理細胞中得到了67個轉化克隆：開創了外源基因的電脈衝方法。目前在動物中電脈衝法主要用來轉化胚胎幹細胞。

精子導入法

利用精子作為外源基因載體，藉助受精作用把外源綦因導人受精卵，整合到受精卵的基因組中，稱之為精子載體導入法，是構建轉基因動物的一種新嘗試。該法簡單、方便，依靠生理受帶過程，免去了對原核的損傷。但在實踐中成功率較低，對精子是否可作為外源DNA的載體也存在爭論。目前這_技術尚處在探索階段。該法可以將人工授精、體外受精與轉

一、發育生物學的研究

轉基因動物可用於觀察目的基因在胚胎不同發育階段的特異性表達、關閉及調控機制，了解調控順序(如增強子、啟動子)在組織特異性表達中的作用，例如人腎素基因在小鼠體內的特異性表達可能與該基因的5’端側翼順序有關。此外，轉基因動物還可用於識別動物發育過程中的基因(包括內源基因)及其活動，也可測出與動物發育相關的未知基因的表達特性。

二、遺傳學研究

利用自然突變或人為修飾的基因作為外源基因，構建轉基因動物，研究導人的異常基因的表型效應，可以了解基因站構和功能的蓋系，還可用於基因組印跡分析、遺傳缺陷的矯正等。

一、心血管疾病的研究

各種調節心血管功能的因子如轉脂蛋白、轉纖維蛋白溶酶原等都可通過轉基因動物來了解其生理功能及作用，建立如動脈粥樣硬化、突發性高血壓、靜脈閉塞等轉基因動物模型。

二、腫瘤學研究

腫瘤基因的發現是近10年來腫瘤學研究的重大突破，現已發現乳腺癌基因等100多個腫瘤基因。實驗證明，各種脊椎動物都攜帶腫瘤基因，在通常情況下並不引起細胞癌變，只有在某些條件下才能被激活使癌細胞增生而導致癌變。建立帶有腫瘤基因的轉基因動物可了解哪些組織對腫瘤基因轉化活性敏感、腫瘤形成與其基因的關係、腫瘤基因生長分化影響等等。

三、遺傳病研究

通常是將功能正常的外源基因導入動物體的靶細胞內，用來彌補缺陷的基因，改變患病細胞的遺傳物質，進行基因治療。相反的將顯性疾病基因或一個、甚至多個外源基因人為地導入動物體內，就可製備遺傳性疾病的轉基因動物模型，研究和治療人類遺傳性疾病。例如亨廷頓(Hungtington)將舞蹈病基因導入小鼠，建立了舞蹈病動物模型，雷德黑得(redhead)將正常小鼠的MBP(髓磷脂鹼性蛋白)基因導入震顫小鼠，小鼠的震顫癥狀消失。

四、免疫學研究

巴賓耐特(Babinet)發現雖然轉基因小鼠產生HBsAg，但在6個月內沒有任何病理變化，表現為一種持續的帶病毒狀態。這些結果表明：乙型肝炎患者的肝細胞損傷不是由HBV的HBsAg表達直接引起，而是通過對肝細胞膜上的病毒抗原發生免疫反應造成的。因此，可以用轉基因小鼠模型來研究免疫耐受與肝細胞損傷的關係以探討發病機制。此外，轉基因小鼠還為研究第l和第Ⅱ類主要組織相容性抗原的功能提供了新手段。

經典的遺傳育種方法要在同種或親源關係很近的種間才能進行，並且受到變異或突變的限制，而使用重組DNA技術在短時間內就可使親緣關係很遠的種間遺傳信息進行交換和重組。另外由於轉基因動物可以穩定地整合外源基因，並在合適的組織表達，還能將這種性狀遺傳給後代，這樣就可以生產出生長快、產肉、產毛、產奶更多而耗料極少的轉基因家畜，為家畜改良提供一條重要的途徑。

將在醫學領域中有價值的生物活性蛋白基因導人家畜或家禽的受精卵，在發育成的轉基因動物體液或血液、乳、尿、腹水中收穫基因產物，便可獲得大量有價值的生物活性蛋白，通常將此動物稱為“動物生物反應器”。其中以乳汁為最理想的分泌部位。目前，tPA(組織型纖溶蛋白元激活因子)已在轉基因小鼠的乳汁中得到了表達，成為治療血栓的理想藥物。β-乳球蛋白在轉基因小鼠中可表現出羊奶的主要成分——β-乳糖球蛋白。此外，凝血因子Ⅳ和α1-抗胰蛋白酶也在轉基因綿羊中得到了表達。其他如乙型肝炎病毒抗原、卵泡刺激素、促黃體生成素等也都能按需要利用轉基因動物生產，為醫藥、食品及畜牧業的發展開闢了極為廣闊的天地。

疾病動物模型對醫學的發展作出了貢獻。但是，許多疾病難以用人工誘發的方法製造動物模型，或許多疾病在實驗動物身上不發生或僅僅是高等哺乳類動物才發生，因此難以通過自發或人工定向培育的方法獲得動物模型。轉基因技術的出現，為人類精確地研究基因與疾病的相關關係提供了可能，而且可以在個體發生的每個階段中使用任何個體進行遺傳功能的分析。因此，轉基因疾病動物模型的開發成為轉基因動物的熱點，有的已進入應用階段。

一、病毒性疾病模型

（1）小兒麻痹病毒受體轉基因小鼠：把人的小兒麻痹病毒受體克隆並製作轉基因小鼠。將小兒麻痹病毒的細胞性受體基因(human PVR gene)顯微注射至C57BL／10小鼠的早期胚胎中，製作轉基因小鼠並育成品系。這種小鼠表達人源的受體，有小兒麻痹病毒的感受性。而且感染了這種病毒的小鼠表現出和人一樣的臨床癥狀，對病毒株的特異性也表現出與人相同的性質。因此，這種小鼠除了是人的疾病模型之外，同時還可能替代猴子進行小兒麻痹病毒的效果、特異性等的檢定，具有廣泛的用途。

（2）乙型肝炎病毒攜帶者模型：乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)攜帶者的肝癌發生率為正常人的100~200倍，但尚缺乏有效的治療方法。HBV只感染人或大猩猩，尚未研究出其他適宜的動物模型。通常認為，對HBV的免疫應答是受基因支配的，其免疫應答不充分者則成為慢性肝炎；肝癌的發生機制並不是單一的，由慢性肝炎的存在引起的肝細胞壞死和再生之問存在種種的遺傳變異並出現癌變。HBV基因組是含有部分單鏈區的環狀雙鏈DNA分子，兩條單鏈長度不一，長鏈為負鏈(3.2kb)，短鏈為正鏈，約為負鏈的50％～80％。因此，如果使l．2HB-BS的DNA成為兩端重複的線狀DNA用於轉導，可實現全基因組的表達。另一方面，當僅要求HBS抗原表達時，僅需要導入1.2HB-BS基因即可。將添加了l.2HB-BS的HBV DNA導人C57BL／6J小鼠，在肝複製HBV，在血中釋放病毒粒子。基因的表達在胚胎期發生，但對這些病毒抗原表現免疫寬容(鈍化狀態)，不表現任何病理學變化，因此可作為人HBV攜帶者的模型。導人基因的小鼠與人一樣，臨床表現沒有任何異常。

（3）乙型肝炎表面抗原轉基因動物模型：將人乙型肝炎表面抗原(HBsAg)基因導入小鼠，可獲得轉HBsAg基因小鼠，而且該轉基因小鼠的肝中可以產生HBsAg。這種轉基因小鼠既可以模擬患者的帶毒狀態又不導致發病。奇薩利(Chisari)發現，HBsAg陽性的轉基因小鼠用HBsAg加上福氏完全或不完全佐劑免疫，不能誘導產生特異性抗體，而HBsAg陰性的轉基因小鼠則有應答反應，HBsAg陽性的轉基因小鼠在6個月內未出現任何病理改變，卻表現為持續的帶毒狀態。這些試驗結果表明，乙型肝炎患者的肝細胞損傷不是由HBsAg表達直接引起的，而是通過對肝細胞膜上的病毒抗原發生免疫應答反應造成的。這種轉基因小鼠模型可用來研究免疫應答耐受與肝細胞損傷的關係，探討發病機制、持續帶毒狀態及其清除、藥物篩選實驗、HBV DNA在宿主內的複製、表達及調控與乙型肝炎發病的關係等有關HBV病理學和治療學方面的難題。

除上述轉基因小鼠動物模型的建立之外，尚有一些其他病毒性疾病的轉基因小鼠動物模型也得以建立。如注射JC病毒基因組獲得的轉基因小鼠，可以用作多發性白質腦病(progressive multifocal leukoencephalopathy，PML)的轉基因小鼠動物模型，利用人T淋巴細胞l型病毒(HTLV-1)的酪氨酸轉氨酶(TAT)基因製備的轉基因小鼠，可作為人神經纖維癯的疾病動物模型等。

二、腫瘤轉基因動物模型

哺乳類動物的DNA攜有癌基因(oncogene)，在理化或生物因子作用下被激活，引起細胞增殖、分化的調控失常以及與周圍組織關係的紊亂，從而導致癌變。用癌基因或致癌病毒基因製作腫瘤轉基因動物模型，可以探討外來癌基因與實驗動物的原癌基因(susceplible protooncogene)、癌基因表達與癌轉化、癌基因表達與動物遺傳背景或外界激活因素的關係。

通過向小鼠受精卵插入癌基因或原癌基因培育轉基因小鼠，可在整體水平上研究癌基因對細胞正常分裂分化的影響，從而可以準確地研究癌基因與腫瘤形成的關係。例如，SV40T抗原基因是一個在轉基因小鼠中得到廣泛研究的轉化基因。布林斯特(Brinster)等(1984)將T抗原序列與其自身的增強一啟動子序列相連后導入小鼠，發現外源基因可在小鼠的中樞神經系統優先表達並引起脈絡叢乳頭狀瘤。將T抗原序列與不同的啟動子序列連接后的重組分子，導入小鼠后也能在啟動子序列表達的組織引起腫瘤。這些組織分別是胰、肝、眼晶狀體，甚至心肌組織等。

另外，像病毒癌基因、細胞原癌基因與不同啟動子連接后，也被導入小鼠並獲得轉基因動物。如將C-myc癌基因置於小鼠乳腺腫瘤病毒(mMTV)基因啟動子的調節下，獲得了轉基因小鼠。這些小鼠在胸部、睾丸和淋巴組織等部位都可引起腫瘤。這些試驗結果表明，原癌基因的異常調節有使組織易於惡化的傾向。

上述轉SV40T抗原基因和c-myc基因小鼠的研究結果有力地支持了腫瘤多步發生的假說，即腫瘤的發生至少需要二次轉化。如轉T抗原和c—myc基因在各個器官都得以表達，但只在少數幾個器官發生癌變。

三、代謝性疾病轉基因動物模型

（1）高歇(Gaucher)病轉基因動物模型

Gaucher病是葡萄糖苷酶缺損(溶酶體酶的一種)引起內臟葡萄糖腦苷脂積蓄的代謝病。依臨床癥狀可分為3種類型，其中，成人型(1型)和亞急性青年型(Ⅲ型)發生肝脾腫大或貧血、骨質疏鬆，急性嬰兒型(Ⅱ型)則表現痙攣等中樞神經癥狀。各型的肝、脾、淋巴結、骨髓等出現Gaueher細胞(含有葡萄糖腦苷脂的巨噬細胞)。已報道了自發裸鼠和實驗誘發模型，但在治療等方面的研究還不充分。

改造小鼠的β-葡萄糖苷酶基因，並以此為基礎進行基因打靶。在外顯子9和外顯子10之間構築具新青霉素磷酸轉移酶抗性基因(neor)或在3’端構築具有HSV-tk的靶載體(targeting vector)，在ES細胞中實施PNS(正負選擇法)選擇。其後，對嵌合小鼠進行品系化培育，分析純合子或雜合子。與正常個體的β-葡萄糖苷酶活性相比，雜合子為44％，純合子為4％。純合子中表現了p葡萄糖腦苷脂的積蓄。純合子個體大小正常或比雜合子明顯小，呈現呼吸困難、發紺。這樣的個體不被母鼠飼養，全部都在24h內死亡。病理顯示肝、骨髓、腦、脾的巨噬細胞溶酶體內脂肪積累，和人的病理改變相同，只是這種小鼠的肝，在胎兒早期可以見到血細胞的分化圖像，雖然巨噬細胞溶酶體中有脂肪積蓄，但是急死的情況並不多見。可以認為，與Gaucher病Ⅱ型的小兒患者所見的急性神經癥狀是一致的。

該模型是現有轉基因疾病動物模型中評價最高且已得到應用的基因模型之一。

（2）FAP轉基因小鼠

家族性神經多發性澱粉樣變(familial amyloidotic polyneuropathy，FAP)是常染色體顯性遺傳的疾病，發生全身的細胞外澱粉樣蛋白沉著，是以末梢神經和自主神經損害為主的疾病。澱粉樣蛋白的主要成分發生變異，患者大部分是第30位纈氨酸置換為蛋氨酸，已證明是變異氨基酸所對應基因的鹼基出現置換。因此，從病因上講，它是蛋白質變異直接導致澱粉樣蛋白沉著的疾病。構建帶有金屬硫蛋白基因MT啟動子的變異澱粉樣蛋白基因並用轉基因方法整合到C57BL／6J小鼠，對該轉基因小鼠的分析結果表明，變異澱粉樣蛋白基因表達從胚胎期就可見到，而變異澱粉樣蛋白沉著則發生於青春期，以後隨著年齡的增加沉著量逐漸加大。

但是，該病在人的末梢神經或自主神經出現澱粉樣蛋白沉著，而在轉基因小鼠中則不出現。這是否由於小鼠與人的組織學特徵存在差異，目前尚不清楚。由於這一原因，轉基因小鼠不出現臨床癥狀。

從這些小鼠的分析已經清楚了解下面4點：①由tranethyretin分子組成的四聚複合體在血中的變化對澱粉樣蛋白的沉著是重要的；②澱粉樣蛋白中的微小成分即血清澱粉樣蛋白P成分不對澱粉樣蛋白沉著的開始、伸展、組織分佈帶來任何影響；③各組織的微小環境，即血流量豐富度、組織密度對澱粉樣蛋白沉著量有較大的影響；④小鼠的飼育環境影響澱粉樣蛋白的沉著。該轉基因小鼠的關鍵問題是，末梢神經和自主神經並不發生澱粉樣蛋白沉著。闡明這一問題對今後開發治療方法將是重要的。

目前，轉基因疾病動物模型的研究大部分局限予單個基因的轉移。而生物學功能的表現以及疾病的發生通常是基因與基因之間相互作用的結果，故研究導致疾病和中醫證型的功能基因組，利用轉基因技術製作功能基因組動物模型更有意義。功能基因組動物模型的開發將隨著人類基因組計劃的完成而逐步得以實現。

基因治療(gene therapy)即用分子生物學技術將外源基因導入靶細胞，以糾正、補償基因缺陷或者抑制和阻斷異常基因的過度表達，從而達到治療疾病的目的。基因治療包括基因補償、基因糾正、細胞因子基因導入、反義RNA技術等。該技術作為一種全新治療疾病的手段，發展極快，並有幾例已進入臨床實用階段，解決了傳統方法無法解決的臨床難題。這一新穎獨特的治療方法，也是起源於對轉基因小鼠的研究。

基因治療的動物模型製作，目前普遍採用反轉錄病毒為載體法導入外源目的基因。這種重組的反轉錄病毒能將所攜帶的功能性基因整合到受體細胞染色體上，導入基因的表達產物將彌補原來缺少的基因產物。一種缺乏生長激素的小鼠，通常體型比一般小鼠小且雄性不育。將生長激素基因導人這種小鼠，通過外源生長激素基因的表達可使原來患“侏儒症”(dwarf)的A、鼠個體增大3倍，而且可恢復雄性的繁殖力；缺乏主要組織相容性複合體(major histocompatibility complex，MHC)系列基因的小鼠對合成抗Ig缺乏免疫應答，但轉MHC基因小鼠卻可恢復免疫應答能力；有β地中海貧血的小鼠，導入小鼠或人的8球蛋白基因后，貧血程度得以減緩。

基因治療動物模型的製作，還可以採用導入反義基因方法。該方法適合於由某些基因異常表達引起的疾病。具體是將反義DNA注入受精卵，使之整合到染色體組並表達與致病mRNA序列互補的RNA，通過形成RNA雙鏈使致病mRNA不能翻譯。人的神經性震顫是由於髓磷脂鹼性蛋白(MBP)減少而引起的疾病。將MBP的反義DNA整合到小鼠染色體基因，其MBP合成降低為正常的50％～70％，因而出現震顫，製作了震顫動物模型。在小鼠中，也發現MBP缺損的突變體，表現自發的震顫。相反，在這些突變體中轉入MBP DNA，則形成髓磷脂鹼性蛋白。當這種mRNA表達量達到正常MBP量的25％以上時，癥狀消失，表現了明顯的癥狀回復(治療)以及發病與MBP表達水平的關係，為基因治療的轉基因動物製作提供了另一條途徑。