糖基轉移酶

代煥琴 王浩鑫 沈月毛

糖苷類抗生素是臨床上廣泛應用的抗菌和抗腫瘤化合物。該類化合物在體內由糖基轉移酶催化，糖基化反應通常在抗生素生物合成的最後發生，糖基的位置、類型和數量對糖苷類抗生素的活性有很大的影響。本文綜述了糖基轉移酶的種類、功能、特性及其在組合生物合成中的應用與研究前景。

抗生素的糖基轉移酶 抗生素糖苷 糖基化

Recent advances in antibiotic glycosyltransferases ABSTRACT Glycoside antibiotics, a category of compounds widely used clinically for anti?bacterial and anti?cancer, are catalyzed by antibiotic glycosyltransferases (Gtfs) in vivo. The sugar moieties are transferred to the corresponding aglycon by Gtfs, often work at very late stages of biosynthesis of antibiotics. The position, type and number of sugar moieties incorporated to the antibiotics have great impact on its bioactivity. This article provides an overview of the categories, functions, characteristics of Gtfs, their applications in combinatorial biosynthesis, and the prospects for research.

KEY WORDS Antibiotic glycosyltransferase; Glycoside antibiotics; Glycosylation

抗生素糖苷在臨床上主要用於抗菌和抗腫瘤，在抗生素生物合成基因簇中已經發現了很多編碼糖基轉移酶的基因[1]，但人們對抗生素糖基轉移酶(antibiotic glycosyltransferases，Gtfs)的特異性和催化機制了解不多。糖基與不同配基的結合能大大增加天然產物的結構多樣性，在功能上，這些糖組分通常參與目的細胞的分子識別，影響化合物的生物活性[2]。目前，隨著抗生素的廣泛使用，耐葯菌也在逐年增加，迫切需要尋找新的抗生素來與之抗衡。通過糖基化增加抗生素種類和改變抗生素活性是一條很有前景的途徑，探討糖苷類抗生素的產生機制和糖基轉移酶的催化特徵，有望為發現和改造新活性的抗生素奠定基礎。

1 糖苷類抗生素

很多糖苷類抗生素在生物合成中經過了立體和區域選擇性的糖基化，在這一生物反應中，糖基轉移酶催化其結構中的糖基以單糖、雙糖和寡糖鏈的形式結合到配基上從而形成特定的C?、N?和O?苷(Fig.1)。糖苷類抗生素的生物合成途徑中，糖基化通常是后修飾的最後一步，如萬古黴素(vancomycin)、替考拉寧(teicoplanin)的糖鏈都是在生物合成的最後引入的[3]。Fig.1 The C?, N? and O?glycoside antibiotics

糖苷類抗生素的作用機制主要有兩類，一類是通過抑製革蘭陽性菌肽聚糖的合成，如雷莫拉寧(ramop?lanin)[4]；另一類是抑制DNA促旋酶的活性，如新生黴素(novobiocin)[5]。

2 糖苷類抗生素中糖基的主要作用

糖基化的作用和意義主要體現在以下三個方面：第一，增加化合物的水溶性。己糖衍生物結合到抗生素糖苷配基上，增加了抗生素的親水性利於藥效的發揮，典型的有替考拉寧環七肽上的N?乙醯葡萄糖胺(N?acetyl?glucosamine，GlcNAc)和雷莫拉寧骨架上的甘露糖鏈；第二，利於分泌。A40926生物合成途徑中的甘露糖基轉移酶(mannosyltransferase)特異識別mannosyl?PP?C55作為糖供體，使糖基化的抗生素利於分泌[6]。第三，糖基化是產生菌的一種自我保護機制。在竹桃黴素(oleandomycin)的產生過程中，糖基轉移酶OleD使中間態抗生素糖基化，造成其在胞內短暫失活，抗生素分泌后，再由糖苷酶水解去除糖基，使其恢復活性[7]。該機制在大環內酯類抗生素中比較常見，類似功能的酶還有MgtA[8]。

3 糖基轉移酶

糖基轉移酶在生物體內催化活化的糖連接到不同的受體分子，如蛋白、核酸、寡糖、脂和小分子上，糖基化的產物具有很多生物學功能。在不同的Gtfs家族中存在一類與抗生素生物合成相關的Gtfs，它的功能是在抗生素生物合成的後期使其糖基化，通過糖的位置、類型和數量的改變對抗生素的活性進行調節。

隨著對抗生素生物合成基因簇的深入研究，從放線菌中已經分離了100多個抗生素生物合成相關的糖基轉移酶基因，序列分析表明這些基因編碼的蛋白都屬於糖基轉移酶家族。大多數糖基轉移酶基因都具有靠近C端的富含甘氨酸(glycine?rich)的保守區，該保守區也存在於UDP?糖基和UDP?葡糖醛酸基轉移酶中。選擇GenBank中註冊的有代表性119條糖基轉移酶序列，用PAUP 4.0軟體進行系統分析，以近鄰法構建系統進化樹(Fig.2)。進化樹的分析結果表明，糖基轉移酶基因之間親緣關係的遠近，並不能很準確的推斷其生物學功能[9]，例如，EryCⅢ和MegC Ⅲ，在氨基酸水平上具有83.4%的一致性，能識別同樣的配基，UrdGT1b和UrdGT1c表現出了很高的同源性(具有91%一致的氨基酸和僅在31個氨基酸區域內有幾個不同的氨基酸)，但是它們卻轉運不同的己糖，UrdGT1c轉移L?夾竹桃糖(L?rhodinose)，UrdGT1b轉移D?橄欖糖(D?olivose)[10]。催化C?C、C?N與C?O糖苷鍵形成的糖基轉移酶，在基因的序列和氨基酸水平上並沒有明顯的差異，如Asm25(安絲菌素醯胺糖苷生物合成途徑中催化C?N糖苷形成的Gtfs)[9，11]、UrdGT2(烏達黴素生物合成途徑中催化C?C糖苷形成的Gtfs)[12]、GtfB(萬古黴素生物合成后修飾中催化C?O糖苷形成的Gtfs)[13]。

在萬古黴素的后修飾過程中，糖基轉移酶GtfB的Fig.2 A dendrogram of different antibiotic glycosyltransferases功能是將UDP?葡萄糖中的葡萄糖基轉移到萬古黴素的骨架上，對其晶體結構的研究表明，該酶具有兩個結構域，存在於中間區域的溝可能包含UDP?葡萄糖的結合區域[13]。糖基轉移酶的結構測定將有助於我們深入研究其催化特異性。

Gtfs的兩個顯著特徵是：第一，在抗生素生物合成過程最後起作用，這一點使其在組合生物合成中能得到靈活的應用，其底物結構特異性的闡明可以為新結構和新功能化合物的發現奠定基礎。Gtfs催化的糖基轉移反應中，己糖的C1通過三磷酸核苷的去磷酸來激活，從而在親電子的C1位置上捕獲糖基底物，然後經親核攻擊，與糖苷配基的羥基結合。第二，大部分的糖基轉移酶可以催化活化的己糖結合到糖苷配基底物的羥基上，形成C?O糖苷，僅少數例外，如在rebeccamycin[14]和urdamycin[13]的衍生物中存在糖基通過C?N和C?C鍵與糖苷配基結合的化合物。安絲菌素的YMG平板培養發酵物分離得到了安絲菌素醯胺N糖苷類化合物，其結構中的糖基通過醯胺鍵上的N與糖苷配基骨架相連[11]。在urdamycin的生物合成中，可能是由於親核的C原子和酚類的羥基處於鄰位導致C?C糖苷鍵的形成[12]，但是催化C?N和C?C形成的糖基轉移酶其特異性還沒有得到深入的研究。

3.1 Gtfs的應用研究

(1)生物體內的研究 Gtfs的體內研究主要採用遺傳學方法進行，一種方法是通過質粒介導的基因替代宿主菌自身的TDP?去氧己糖合成酶基因，篩選到的突變體作細胞工廠用於抗生素的改造。這些研究包括工程化的daunomycin(道諾黴素)[15]途徑用於苦黴素(pikromycin)產生菌S.venezuleae和urdamycin的產生菌S.fradiae中生產4′?差向異構的糖基和具有不同糖單元的蒽環類抗生素[16，17]。

另外一種方法是在不同的宿主中異位表達Gtfs，這方面的例子包括在宿主S.erythraea中表達oleGII基因產生3?O?rhamnosyl?6?DEB、表達tylM2基因產生5?O?desosaminyl(tylactone)[18]。

研究表明Gtfs對不同的糖分子具有底物適應性，Salas的研究組創造出了共表達系統，該系統把來源於elloramycin生物合成基因簇中的糖基合成基因盒(Cassette)和糖基轉移酶基因elMGT在一起成功地表達[19]。儘管很多糖基轉移酶的底物廣譜性已得到了證明，但仍有很多文獻還是報道了特異性的糖基轉移酶基因的存在，例如，C.cyanogenus中的UrdGT2[20]和來自S.spheroid NCIMB11891的NovM[21]。勿庸置疑，隨著更多Gtfs編碼基因被發現以及作用機制的深入研究，在生物體內進行抗生素糖基化修飾的策略和模式也會增加。因此，建立多樣化的微生物工廠來生產不同糖基修飾的天然產物，如表達糖基化修飾的聚酮(PK)，非核糖體肽(NRP)和雜合的PK/NRP類抗生素，可以為篩選新活性化合物提供可能。

(2)Gtfs的體外研究 Gtfs的體外研究依賴有活性的Gtfs、多樣化的糖苷配基和糖基供體。由於抗生素糖基轉移酶在體內含量很低，異源表達操作相對簡便，所以研究者多以異源表達方式在微生物如E.coli或者S.lividans中進行異源表達獲得[22]。已經有幾個成功的例子，如NovM首次在S.spheroides中發現並克隆，並以活性形式在E.coli中表達和純化[21]。通過化學合成和生物酶催化的方法來產生TDP?D?葡萄糖都是可能的[23]。比較而言糖苷配基最容易得到，可以通過母體抗生素的降解控制其產生，如相應糖苷配基很容易從萬古黴素和替考拉寧分別獲得，novobiocic acid可以從酸催化新生黴素的反應中獲得。除此之外，不同的配基還可以通過全合成或部分修飾來得到。如化學合成daunomycin、carminomycin(洋紅黴素)和博來黴素(bleomycin)的衍生物[23～25]。

4 糖基轉移酶在組合生物合成的應用

應用遺傳學方法生產新型聚酮和多肽類化合物日益得到人們的重視，表面上看重組生物合成糖基化的化合物和聚酮、多肽一樣複雜，但是和聚酮、多肽合成酶的複雜性相比，由於催化去氧糖產生的酶及其反應機制比較保守，因此重組合成糖基化的化合物更有實踐意義[25]。

西班牙的Salas研究組已經建立了成功的基因克隆和表達系統用來生產活化的去氧糖，目的基因處於操縱子的下游，通過啟動子的控制可以在鏈黴菌中表達。在鏈黴菌Streptomyces albus中整合糖基轉移酶基因oleGII，導入合成L?夾竹桃糖(L?oleandrose)的質粒后，合成紅黴素內酯B(erythronolide B)，而整合糖基轉移酶基因elmGT后再導入生物合成L?橄欖糖(L?olivose)的質粒pOLV可以成功生產特麴黴素(tetracenomycin C)[26，27]。

Staurosporine(十字孢鹼)類化合物的結構是由一個糖分子和一個雜環的吲哚卡唑單元組成，通過化學手段較難得到，通過在一個生物體內共表達rebeccamycin和其它staurosporine類化合物生物合成基因，分離鑒定了大約產生了30種staurosporine類衍生物[28]。通過遺傳學方法改變Gtfs的特異性有一定難度，Salas研究組通過共表達糖基生物合成基因盒、Gtfs基因(staN和staG)和staurosporine的生物合成基因成功地替代了天然附加在吲哚卡唑基團上的糖基，為糖基轉移酶在重組生物合成中的應用奠定了基礎，證明重組生物合成在生產新的糖基化產物中較藥用化學更有利[16]。

4.1 使用產生菌作為細胞工廠

用產生糖苷化合物的微生物作為細胞工廠，在基因的編碼區通過插入抗生素抗性標記或刪除部分基因進行敲除產生突變體，引入外源糖基轉移酶基因，使其利用細胞內活化的糖分子和微生物次生代謝的中間體合成新的抗生素。這種方法已經在很多生產菌株如紅黴素(erythromycin)[29]、普卡黴素(plicamycin)、urdamycin、酒黴素(methymycin)[29]和苦黴素(pikro?mycin)上得到應用[30]。

另外一種促使不同糖單元結合到配基上的策略是在產生類似生物活性化合物的有機體上異源表達Gtfs，宿主作為細胞工廠提供核苷激活的糖源。配基骨架可以由宿主合成，也可以通過控制宿主的染色體基因和外源基因來合成，或者用化合物進行飼餵。通過把來源於萬古黴素產生菌A.orientalis的基因gtrE在不產生糖基多肽A47934的鏈黴菌S.toyocaensis中進行表達，形成了新的糖基A47934衍生物[17]。

Gtfs轉運不同的糖到配基骨架的特定C原子上，而用基因工程的方法改變糖在骨架上的位置更有意義，這一設想成功產生了雜合的urdamycin和普卡黴素抗腫瘤藥物[30]。

4.2 使用非產生菌作為細胞工廠

在重組菌株的轉化實驗中，由於宿主不產生配基骨架，需要整合一個具有配基骨架生物合成基因的質粒到宿主上或者把配基添加到培養基中，通過生物轉化進行修飾。糖分子則是通過轉移一個或多個含有必須基因的質粒來提供，現在一些可以合成不同去氧己糖的質粒已經作為一種重要的工具被開發出來[31]。

5 糖基轉移酶的研究前景

最近，在糖肽的生物合成系統中得到了Gtfs的晶體，結構測定表明這類Gtfs家族有兩個共同的結構域。NDP?糖結合到C?端，糖苷配基結合到N?端(AGV/GtfB，DVV/GtfA)[13]。這個兩裂的結構僅僅由兩個肽連接到一起，提示混合和匹配各自的結構域是可以實現的[32，33]。因此，DNA shuffling或相關酶定向進化可以構建看似荒誕的Gtfs，改變其對己糖單元和配基的底物特異性，大大提高糖苷類化合物的結構多樣性，為篩選到新活性糖苷類抗生素奠定基礎。

總之，在生物合成中研究糖基化模式的多樣性需要滿足三個要求。

(1)建立糖基轉移酶庫 通過重組生物合成生產新的抗生素糖苷，必須建立糖基轉移酶的基因庫，才能使之在工業上得到深入應用。隨著更多基因簇的序列測定，Gtfs的數目也會逐年增加，發現具有混合和匹配的N?或C?端的Gtfs區域用於構建雜合催化體系，改變配基和去氧糖的識別，可以為特定的去氧糖單元尋找新結合位點[34]。

(2)建立配基的化合物庫 這些化合物包括簡單的氨基香豆素類骨架(aminocoumarin scaffolds)、非核糖體肽(NRP)以及芳香化的聚酮配基[25]。但是，由相似酶催化進行C?N，C?C糖基化還有待於進一步的研究。

(3)建立糖供體的化合物庫 糖供體要包括很多UDP或TDP活化的糖和去氧糖。天然去氧糖附加到配基上以後，賦予了配基新的活性。去氧糖的氨甲醯化在很多類型的化合物如聚酮(新生黴素)、非核糖體肽(如替考拉寧)等抗生素中都存在，因此所有TDP?D?和TDP?L?去氧己糖衍生物在庫中都值得準備[32，33]。

迄今為止已經發現了很多與抗生素生物合成相關的糖基轉移酶，但現有的研究還不深入，對糖基化生物學意義、糖基轉移酶結構和功能關係、催化機制、糖苷的活化形式以及組合生物合成的應用等有待進一步探討。沈月毛研究組發現糖苷化與微生物的生長條件有關，同一個菌株在平板培養時產生的糖基化產物在液體培養時卻檢測不到。催化三種不同類型糖苷形成的糖基轉移酶之間在其作用機制及底物選擇性方面到底存在那些異同，都有賴於不同類型糖基轉移酶高級結構的闡明，離實用化、產業化還有很長的一段路要走。

[1] Thoroson J S, Hoster T J, Jiang J, et al. Nature′s carbohydrate chemists: the enzymatic glycosylation of bioactive bacterial metabolites [J]. Curr Org Chem,2001,5(2):139

[2] Weymouth?Wilson A C. The role of carbohydrates in biologically active natural products [J]. Nat Prod Rep,1997,14(2):99

[3] Losey H C, Peczuh M W, Chen Z, et al. Tandem action of glycosyltransferases in the maturation of vancomycin and teicoplanin aglycones: novel glycopeptides [J]. Biochemistry,2001,40(15):4745

[4] Cudic P, Kranz J K, Behenna D C, et al. Complexation of peptidoglycan intermediates by the lipoglycodepsipeptide antibiotic ramoplanin: minimal structural requirements for intermolecular complexation and fibril formation [J]. Proc Natl Acad Sci,2002,99(11):7384

[5] Gellert M, O′Dea M H, Itoh T, et al. Novobiocin and coumermycin inhibit DNA supercoiling catalyzed by DNA gyrase [J]. Proc Natl Acad Sci,1976,73(12):4474

[6] Sosio M, Stinchi S, Beltrametti F, et al. The gene cluster for the biosynthesis of the glycopeptide antibiotic A40926 by nonomuraea species [J]. Chem Biol,2003,10(6):541

[7] Quiros L M, Aguirrezabalaga I, Olano C, et al. Two glycosyltransferases and a glycosidase are involved in oleandomycin modification during its biosynthesis by Streptomyces antibioticus [J]. Mol Microbiol,1998,28(6):1177

[8] Gourmelen A, Blondelet?Rouault M H, Pernodet J L. Characterization of a glycosyl transferase inactivating macrolides, encoded by gimA from Streptomyces ambofaciens [J]. Antimicrob Agents Chemother,1998,42(10):2612

[9] 代煥琴. 安絲菌素生物合成的后修飾研究[D]. 中國科學院博士學位論文，2006：40

[10] Walsh C T, Losey H C, Freel C L. Antibiotic glycosyltransferases [J]. Biochem Soc Trans,2003,31(Pt3):487

[11] Lu C, Bai L, Shen Y. A novel amide N?glycoside of ansamitocins from Actinosynnema pretiosum [J]. J Antibiot,2004,57(5):348

[12] Hoffmeister D, Ichinose K, Bechthold A. Two sequence elements of glycosyltransferases involved in urdamycin biosynthesis are responsible for substrate specificity and enzymatic activity [J]. Chem Biol,2001,8(16):557

[13] Mulichak A M, Losey H C, Walsh C T, et al. Structure of the UDP?glucosyltransferase GtfB that modifies the heptapeptide aglycone in the biosynthesis of vancomycin group antibiotics [J]. Structure,2001,9(7):547

[14] Sanchez C, ButovichI A, Brana A F, et al. The biosynthetic gene cluster for the antitumor rebeccamycin: characterization and generation of indolocarbazole derivatives [J]. Chem Biol,2002,9(4):519

[15] Otten S L, Liu X, Ferguson J, et al. Cloning and characterization of the Streptomyces peucetius dnrQS genes encoding a daunosamine biosynthesis enzyme and a glycosyltransferase involved in daunorubicin biosynthesis [J]. J Bacteriol,1995,177(22):6688

[16] Zhao Y, Ahlert J, Xue Y, et al. Engineering a methy?mycin/pikromycin?calicheamicin hybrid: construction of two new macrolides carrying a designed sugar moiety [J]. J Am Chem Soc,1999,121(42):9881

[17] Hoffmeister D, Ichinose K, Domann S, et al. The NDP?sugar co?substrate concentration and the enzyme expression level influence the substrate specificity of glycosyltransferases: cloning and characterization of deoxysugar biosynthetic genes of the urdamycin biosynthetic gene cluster [J]. Chem Biol,2000,7(11):821

[18] Walsh C, Freel C L, Losey H C. Antibiotic glycosyltransferases: antibiotic maturation and prospects for reprogramming [J]. J Med Chem,2003,46(16):3425

[19] Blanco G, Patallo E P, Brana A F, et al. Identification of a sugar flexible glycosyltransferase from Streptomyces olivaceus: the producer of the antitumor polyketide elloramycin [J]. Chem Biol,2001,8(3):253

[20] Dürr C, Hoffmeister D, Wohlert S E, et al. The glycosyltransferase UrdGT2 establishes both C? and O?glycosidic bonds [J]. Angewandte,2004,43(22):2962

[21] Freel C L, Anderson J W, Kahne D, et al. Initial characterization of novobiocic acid noviosyl transferase activity of NovM in biosynthesis of the antibiotic novobiocin [J]. Biochemistry,2002,42(14):4179

[22] Mendez C, Salas J A. Altering the glycosylation pattern of bioactive compounds [J]. Trends Biotechnol,2001,19(11):449

[23] He X, M Liu, H W. Formation of unusual sugars: mechanistic studies and biosynthetic applications [J]. Annu Rev Biochem,2002,71:701

[24] Oberthur M, Leimkuhler C, Kruger R G, et al. A systematic investigation of the synthetic utility of glycopeptide glycosyltransferases [J]. J Am Chem Soc,2005,127(30):10747

[25] Wohlert S E, Blanco G, Lombo F, et al. Novel hybrid tetracenomycins through combinatorial biosynthesis using a glycosyltransferase encoded by elm genes in cosmid 16F4 and which shows a broad sugar substrate specificity [J]. J Am Chem Soc,1998,120(41):10596

[26] Salas J A, Mendez C. Biosynthesis pathways for deoxysugars in antibiotic?producing actinomycetes: isolation, characterization and generation of novel glycosylated derivatives [J]. J Mol Microbiol Biotechnol,2005,9(2):77

[27] Sanchez C, Zhu L, Brana A F, et al. Combinatorial biosynthesis of antitumor indolocarbazole compounds [J]. Proc Natl Acad Sci,2005,102(2):461

[28] Salas A P, Zhu L, Sanchez C, et al. Deciphering the late steps in the biosynthesis of the anti?tumour indolocarbazole staurosporine: sugar donor substrate flexibility of the StaG glycosyltransferase [J]. Mol Microbiol,2005,58(1):17

[29] Doumith M, Legrand R, Lang C, et al. Interspecies complementation in Saccharopolyspora erythraea: elucidation of the function of oleP1, oleG1 and oleG2 from the oleandomycin biosynthetic gene cluster of Streptomyces antibioticus and generation of new ery