NASBA

NASBA（Nuclear acid sequence-based amplification，核酸依賴性擴增檢測技術）是一項以RNA模板進行等溫核酸擴增並能實時觀測結果的檢測方法。該技術的檢測反應有賴於AMV逆轉錄酶、噬菌體T7RNA多聚酶、核糖核酸酶H、兩種特別設計的特異性寡核苷酸引物和分子信標探針共同協作而完成。

NASBA全稱是nucleic acid sequence-based amplification，即依賴核酸序列的擴增技術。依賴核酸序列的擴增技術，是一種擴增RNA的新技術，是由一對引物介導的、連續均一的、體外特異核苷酸序列等溫擴增的酶促反應過程。反應在42℃進行，可以在2h左右將模板RNA擴增約10^9～12倍，不需特殊的儀器。NASBA已經廣泛應用於細菌、病毒等多種病原微生物的檢測。

該技術是由一對特異的引物介導的、三種酶催化的以單鏈RNA 為模板的恆溫擴增技術，具有操作簡單、特異性強、靈敏度高、不易被污染等優點，已廣泛應用於病毒、細菌、黴菌、寄生蟲和細胞因子等的檢測，特別是用於艾滋病病毒、丙肝肝炎病毒等RNA 病毒的檢測當中。在動物疫病預防控制方面， NASBA 方法已成為診斷禽流感病毒的國家診斷標準方法之一（GB/T19440-2004 禽流感病毒NASBA 檢測方法）。同時，在植物病害防疫檢查等方面也有重要用途。

儘管RNA的擴增也可以使用反轉錄PCR技術（通過反轉錄形成單鏈DNA模板)，但與NASBA相比，NASBA則有自己的優勢：可以在相對恆溫的條件下進行（一般恆溫為41攝氏度）。該技術主要用於醫學診斷，相對傳統的PCR技術更為穩定、準確。

NASBA的簡要過程如下：1.RNA模板鏈進入反應混合物后，第一個引物首先與模板鏈的3'端結束。2. 反轉錄酶，合成反義的補償的DNA鏈。3. RNA 酶H（一種核糖核酸內切酶，能夠特異性地水解雜交到DNA鏈上的RNA磷酸二酯鍵，分解RNA/DNA雜交體系中的RNA鏈，但不能消化單鏈或雙鏈DNA），分解破壞RNA模板鏈。4.第二個引物與DNA的5’端結合。5.T7 RNA polymerase 合成RNA補償鏈，並加入到步驟1中，使反應可以循環進行。NASBA技術已經被用於多個單鏈RNA基因組的病原性病毒的快速檢測試驗中。

標準的NASBA 反應體系中含有T7RNA聚合酶（一種RNA聚合酶，分子量約99kDa，專門催化5'→3'方向的RNA形成過程）、RNA se H（一種逆轉錄酶，可以消化mRNA）、禽骨髓白血病病毒（AMV）逆轉錄酶、核糖核苷三磷酸（NTP）、脫氧核糖核苷三磷酸（dNTP）、一對特殊引物及根據需要使用的各種反應緩衝液等。引物P1 長約45個鹼基，其3’末端大約20 個鹼基對與模板的3’末端互補，5’末端含有能被T7 噬菌體RNA 聚合酶識別的啟動子序列；引物 大約20個鹼基長，其序列與模板的5’末端一致。AMV 的作用是以單鏈RNA 為模板合成互補的cDNA 及以cDNA 為模板合成雙鏈DNA。RNAseH 在體系中的作用是將RNA-cDNA 雜合分子中的RNA 降解，T7 噬菌體RNA 聚合酶則是識別雙鏈DNA 中的啟動子區，催化DNA 轉錄為RNA。

1 核酸提取

NASBA 方法的核酸提取可按照常規的RNA提取方法進行，根據實際需要可以採取不同的方法。

2 核酸擴增

將純化的RNA 加到標準的NASBA 反應體系中后，先在65 ℃條件下作用5 min 去除RNA 的二級結構，然後在恆溫的42 ℃條件下開始擴增反應。

3 產物的檢測

直接檢測是早期應用的比較簡單的檢測方法，應用的較少。具體操作是將反應產物直接在瓊脂糖甲醛變性凝膠上電泳，用EB（溴化乙錠）染色，在紫外燈下觀察單鏈RNA 片段的長度。該方法只能初步檢測反應產物，如果進一步鑒定反應產物還需要結合其他檢測方法，如Northern blot、限制性酶內切位點分析等。

寡核苷酸檢測該方法，是將NASBA 技術和ELISA (酶聯免疫吸附劑測定)方法相結合，其原理與電化學發光檢測類似，都是通過將與檢測信號有關的物質標記在核酸探針上，通過檢測該信號從而間接檢測RNA。不同的是核酸探針上是用地高辛（Digoxygenin，DIG）標記的，通過探針捕獲將地高辛標記的探針和NASBA 產物的複合物吸附到微量反應板上，作用於底物硝基苯基磷酸鹽顯色，然後通過分析吸光度來檢測RNA 產物。該方法需要使用酶標儀。

國內外的研究結果均表明，草莓組織中富含多糖等物質，分離優質核酸較困難，核酸巾的雜質影響taq DNA聚合酶的活性，從而影響PCR技術在草莓病毒檢測中的應用。為了提高利用PCR技術草莓病毒檢測的穩定性，國內外的學者在草莓核酸提取方法做了較多的研究，利用OIAGEN公司生產的植物RNA提取試劑盒(Plant RNeasv Kit)能夠快速地(約1h)從草莓葉片中提取出較高質量的總RNA。但是這種試劑盒很貴，不適合用於大規模精細的研究應用。

NASBA中主要是反轉錄反應和T7 RNA聚合酶合成RNA的反應。一般認為核酸中的多酚、多糖雜質對反轉錄酶的影響相對較小。對T7 RNA聚合酶受影響可能也較小．而且即使在有DNA污染或存在的情況下．同樣具有較高的特異性和靈敏度。NASBA還具有高靈敏度的優點，與嵌套PCR(Nested PcR)靈敏度相近。因此，利用NASBA檢測草莓植株中的病毒比利用PCR檢測草莓植株中的病毒更為有利。在不涉及病毒含量的定性檢測研究中。可以採用瓊脂糖凝膠電泳來檢測NASBA產物。

NASBA技術不需要PCR儀，在一般實驗室內即可完成，而靈敏度高於PCR，對DNA病毒、RNA病毒和類病毒都可以檢測，在檢測RNA病毒時不受模板中DNA的干擾。為了提高精度，還可以使用分子信標，一般將NASBA技術和分子信標結合稱之為AmpliDet RNA。NASBA在檢測果樹病毒中最早應用於CTV的研究中，以葉片、樹皮為試材皆可以穩定地進行檢測。Vaskova等利用NASBA結合分子信標對SVBV進行了檢測，靈敏度可達到lng(納克)左右。此外，NASBA技術還被用於檢測南芥菜花葉病毒、懸溝子環斑病毒、番茄黑環病毒和番茄環斑病毒、柑橘裂皮類病毒、柑橘類病毒IV的研究中。利用NASBA技術也可以同時檢測多種病毒，如Klerks等同時檢測馬鈴薯卷葉病毒和馬鈴薯病毒Y，Szemes等同時檢測PVY的3個株系。

相對於免疫學方法或其他基因檢測法，NASBA在試驗的快速、敏感性、特異性方面有更多的優勢。

特異性強：NASBA是一種快速、等溫的RNA擴增技術，通過AMV逆轉錄酶和T7 RNA聚合酶進行的擴增反應，因為反應條件溫和以及比PCR短的反應時間，因此轉錄更加忠實於模板，錯配率很低，因而特異性更強。

檢測快速：由於反轉錄過程被直接合併到擴增反應中，因此NASBA最適合分析RNA樣品。在標準條件下，這項測試能在4小時左右結束。

敏感性高：NASBA反應產物是單鏈RNA，因而可採用雜交檢測系統來提高該技術的敏感性和特異性。其敏感性已與傳統的雞胚接種法相當。

適用於檢測樣品的範圍廣：由於NASBA技術的反轉錄過程被直接合併到擴增反應中，因此NASBA最適合分析RNA樣品。樣品中DNA、肝素、檸檬酸鹽、血紅蛋白、白蛋白和脂質等的污染將不會對結果造成影響，因而適用於可能不適合其他試驗檢測的樣品。

NASBA技術的檢測成本較高，大多處於研究階段，但國外的一些研究計劃已將其列為重點發展的檢測手段，並製備檢測試劑盒。

果樹組織中病毒含量一般較低，難以檢測，這對病毒檢測方法有較高的要求。與傳統的果樹病毒檢測方法相比，病毒核酸檢測方法具有檢測速度快、靈敏度高、特異性強等優勢，因而成為果樹病毒檢測發展的方向，特別是以PCR技術為基礎的檢測方法發展迅速。由於NASBA技術進一步提高了檢測效率和檢測速度，因此發展前景較好，特別是利用熒光實時PCR和NASBA同時檢測多種病毒是發展的主要方向。