抗原修復

在免疫組化染色后的鏡下觀察中，有發現這樣的結果，陽性物反應不強，時隱時現，表達不均勻，有時可出現假陰性，這是因為：

1.組織在用甲醛固定的過程中所形成的醛鍵可封閉抗原的決定簇。甲醛與組織蛋白質類的反應是多樣而複雜的，因為它能和多種不同的功能基團結合，在多數情況下在其間形成橋鍵8。這也是甲醛的一個作用，因為它是一種聚合固定劑，因而能在相鄰的蛋白質鍵間形成橋鍵的作用。

2. 甲醛在保存進程中會形成羥甲基，也可封閉抗原決定簇。據French和Edsall的研究認為，最常遇到的甲醇反應，就是加到一個含反應性氫原子的化合物中，形成一個羥甲基化合物。

3.在組織固定過程中，甲醛與蛋白質發生交聯，形成醛交聯蛋白，這種化合物封閉了抗原，使之無法表達出來。

為了解決上述存在的問題，更好地暴露出抗原，將其很好地顯示出來，目前世界上公認的方法就是必須進行抗原修復。

至今為止，抗原修復有許多種方法，在這些方法中，有的是根據抗體的要求來進行，有的是根據抗原的表達程度來進行，我們則對每種病例每項檢測，都要求必須進行抗原修復，以達到抗原全面表達的最佳狀態。

1. 真空負壓抗原修復法：

① 切片脫蠟至水。

②0.3%H2O2甲醇真空負壓處理5分鐘。

③自來水洗，蒸餾水洗。

④0.01M檸檬酸鹽緩衝液（PH6.0），真空負壓乾燥箱預先調至95℃，真空負壓處理10分鐘。

⑤待修復注降至室溫的一，PBS洗3次，隨後按選好的免疫組化染色方法進行染色。

這是一種操作簡單，效果特佳，溫度恆定，能一次性處理大量切片的方法。該法的最大的特點有四：一是各物質的分子在失重的情況下四處飄遊，增加各分子間的碰撞機會；二是有恆定的溫度，既能使甲醛固定的蛋白發生變性，又不需要使抗原修復液達到沸騰，不會導致切片因抗原修復液的沸騰而離開載片，保證了染色的成功率，減少了因掉片而反複製片的麻煩，保證了病理報告的及時發生，為病人爭取更多的時間；三是不受條件限制，不管是金屬性的不是非金屬的都可以進行操作；四是可以一次性製作大批的切片。

2.微波輻射抗原修復法：

①切片脫蠟至水。

②0.3%H2O2甲醇處理10分鐘。

③自來水洗，蒸餾水洗。

④ 0.01M檸檬酸鹽緩衝液（PH6.0），於微波爐內微波輻射10分鐘，如檢測Er和Pr則需要20輻射分鐘左右。

⑤待修復液降至室溫后，PBS洗3次，隨後按選好的免疫組織化學的染色方法進行染色。

該法與上法相比，從實驗結果看，都不分上下。它是利用微波每秒以24億5千萬次的快速運動產生瞬間熱。當然，光靠微波的作用是不夠的，還必須依靠熱的作用，方能達到目的。應用微波輻射，它有雙重作用，微波輻射可以使各物質分子作極性運動。促進形成的醛鍵斷裂開。分子間運動所產生的瞬間熱，當達到有效的溫度后，就可導致甲醛固定后的蛋白的變性。該法的特點是：產熱迅速，容易操作，也容易引起抗原修復液的沸騰，使用微波爐時禁止使用金屬性的器皿，以防引起失火或爆炸。

3.高壓抗原修復法：

①切片脫蠟至水。

②0.3%H2O2甲醇處理切片10分鐘。

③自來水洗，蒸餾水洗。

④切片放入抗原修復液中，邊同容器放入高壓鍋中加熱至沸騰。蓋上壓力閥至噴汽后持續1－4分鐘。

⑤待修復液恢復至室溫后，PBS洗3次，隨後按選好的免疫組織化學染色方法進行染色。

該法高壓和高熱來促進醛鍵的斷裂，當加熱至開鍋，加上高壓閥后，汽體噴出，此時的溫度已達121℃左右。該法被應用於一些較難修復的抗原，經多次實驗認為，該法效果不錯。

4.隔水熱抗原修復法：

①切片脫蠟至水。

②0.3%H2O2甲醇處理切片10分鐘。

③自來水洗，蒸餾水洗。

④切片放入0.01M檸檬酸鹽緩衝液（PH6.0）中，邊同容器一起放入水溶鍋中加熱，其間應不斷用溫度計測其溫度，待抗原修復液的溫度達到有效溫度后（92℃↑）。即開始計時，持續40分鐘。

⑤待抗原修復液恢復至室溫后，PBS洗3次，隨後按選定好的免疫組化染色方法進行染色。

該法應用隔水熱方法，效果不及前面三種方法，它需要較長時間的熱的作用，在早期應用於Er和Pr染色的抗原修復時，我們的修復時間為40分鐘，如果達不到這時間，效果將不理想。

5.電爐加熱抗原修復法：

①切片脫蠟至水。

②0.3%H2O2甲醇處理切片10分鐘。

③自來水洗，蒸餾水洗。

④ 將切片放入抗原修復液中於電爐上加熱，不時用溫度計測量溫度，當達92℃后，即可拔離電源，當溫度低於92℃時，再插上電源，如此反覆持續至10分鐘左右。

⑤待抗原修復液降至室溫后，PBS洗3次，隨後按選定的免疫組化染色方法進行染色。

對各種抗原修復方法的評價。

該法是在沒有上述的設備時才選用的一種方法，當然效果是最差的，因為它只是單靠熱的作用，這是遠遠不夠的，另外，電爐加熱必須常用溫度計來測量溫度，對其溫度不好控制，有時需要多次關閉電源來維持所需的溫度。

1、PH值的應用範圍及選擇。

應用於抗原修復的物質很多，但至今為止，大家公認的最好的抗原修復液還是檸檬酸鹽緩衝液PH6.0，據多年來的實踐認為，該液確實很好，它適合於大多數的抗原，在常規應用的臨床標記抗體中基本都適用，經用該液修復后的抗原表達增強，抗原的定性和定位很理想，結果不錯。但近來也有文獻報道，應用抗原修復液PH8.0的效果也不錯。

2.抗原修復時應選擇最佳溫度。

據Masson等研究表明：70℃－90℃的溫度對沒有經固定的蛋白可發生變性，但經福爾馬林固定的蛋白，要使其發生變性，溫度必須在92℃↑。據實驗認為溫度在92℃－98℃是合適的，尤其在95℃為最好，這是因為：①這種溫度未達沸騰，切片不容易脫離裁片；②能夠解離和破壞與蛋白交聯的甲醛醛鍵等，處理時可以隨意選擇和確定抗原修復的作用時間。

3.抗原修復時有效溫度所需持續時間根據各單位的設備條件以及使用的儀器不同，抗原修復時在有效的溫度範圍內所持續的時間也不一樣。例如：真空負壓抗原修復法，當達到預定的溫度和所需的負壓（66.7KPa）后可持續5-10分鐘，微波輻射抗原修復法溫度不好控制，抗原修復液容易沸騰，如果切片附貼任憑其沸騰持續5-10分鐘。如果切片附貼很牢固，為了防止脫片，一發現抗原液已沸騰，即可關掉電源，待溫度下降后，又可重開電源。如此反覆數次，使之持續10分鐘。不過似這種停停開開著的做法效果不如開著的，因為開著的除了熱效應以外，還有足量的微波輻射。應用高壓抗原修復法，當發現抗原修復液沸騰后，加上壓力閥，出現噴氣后，可持續時間達2-4分鐘。隔水熱加熱抗原修復法，要特別注意內外液體的溫度，內液指抗原修復液，外指浸泡抗原修復液容器的水，應用時用溫度計浸入抗原修復液測試，使之保持在有效的溫度（92℃↑）範圍內。持續時間在40分鐘，電爐加熱抗原修復法，其持續時間在10分鐘以上。由於效果較差，該法目前較少使用。

4.抗原修復液必須遵循自然降溫規律，否則效果不好或達不到抗原修復的目的。

抗原修復持續時間過後，取出放於室溫中讓其慢慢地降溫，決不能為了爭取時間，強行用冰塊或冷水令其降溫。這是因為當高溫中的抗原蛋白分子鏈脫離了其它的束縛或聯結，要有一個自然環境讓其自然放鬆下來，隨著溫度的降低，它們會慢慢地恢復原來的形態和構型。如果用冰塊和冷水強行令其降溫，鬆開后的蛋白分子肽鏈突遇降溫而固定下來，恢復不了原有的構型，達不到預想的效果。

5.盡量使用足量的抗原修復液。

抗原修復的方法，都採用加熱的方法，尤其是微波輻射加熱法，該法由於產熱快。液體容易揮發直至乾涸。因此，應用於抗原修復的液體，一定要充足，防止切片乾涸。用於抗原修復的切片，如果由於液體少而導致切片的乾涸，則應丟棄切片，因為熱乾涸的切片中的抗原是沒辦法補救的，因它是一種不可逆的現象。據實驗認為，用於微波輻射抗原修復的液體，量大可多至1000ml。應用大量的抗原修復液時，由於它的量較大，可延緩了液體的沸騰時間，增加了切片受微波輻射的量，對抗原修復將達到徹底。

6.切片必須附貼牢固。

用於抗原修復的切片，必須附貼牢固，否則發生掉片，則前功盡棄。

1. 胃蛋白酶消化法：

①切片脫蠟至水。

②0.3%H2O2甲醇處理切片10分鐘。

③自來水洗，蒸餾水洗。

④PBS洗3次，1分鐘/次。

⑤滴上配製好或商品化的胃蛋白酶，處理切片20分鐘左右。

⑥PBS沖洗3次，2分鐘/次。

⑦后按選擇好的免疫組化該法進行染色。

2.胰蛋白酶消化法：

①切片脫蠟至水。

②0.3%H2O2甲醇處理切片10分鐘。

③自來水洗，蒸餾水洗。

④PBS洗3次，1分鐘/次。

⑤滴上自配的或商品化的胰蛋白酶，處理切片20分鐘左右。

⑥PBS洗3次，2分鐘/次。

⑦后按選好的免疫組化染色方法進行染色。

評價：上面介紹了胃蛋白酶和胰蛋白酶兩種酶的使用方法，因這兩種酶在平常較常被使用，故而專門進行介紹，除此之外，無有幾種酶如鏈霉蛋白酶，無花果蛋白酶菠蘿蛋白酶等也可被用來消化切片。其用法基本一樣。

現今應用酶來消化切片，主要是根據抗體的要求來進行的，否則都應用物理化學試劑抗原修復法來進行。因為酶消化不適合於多數的抗體，效果也沒有其它方法好，因此臨床上都較少用它。

I、為達到免疫組織化學技術的要求，組織固定越新鮮越好。

在免疫組化最後結果的判斷時，常可見到均勻一片的似非特異性染色的現象，經多方研究認為，它是一種假性非特異性的染色。因為腫瘤組織中含有的抗原較易發生擴散彌散，腫瘤細胞無限制的生長和生長過速，導致腫瘤中間部分組織血液供給困難，造成缺血壞死，壞死細胞中的抗原由於機體的作用，可以被均勻地散佈於細胞與細胞間的間質，這是抗原發生彌散的一種方式。另一種抗原彌散的方式就是，由於組織沒有及時的固定所引起的。離體的組織不及時固定，組織就會自溶，抗原就會擴散，這是一非常普通的常識，但要做好卻是極不容易。標本從外科切除到浸入固定液需要經過一段時間，在這段時間裡，有的抗原就可以發生擴散。雖然已浸入了固定液，但標本較大，固定液的量又不足，當然由於固定液的滲透需要時間，當滲入到組織之中時，中間的細胞已發生了變化，抗原也隨著發生擴散，這種現象在產酶多的器官是比較明顯的，如胃癌，當切除后標本較大，雖然在手術室期間已放入了固定液，但固定液要透過肌層達到胃粘膜面起碼需要幾個小時的時間，當固定液發揮作用時，組織已經發生變化。因此，這了達到免疫組織化學染色的要求，對於離體的組織盡量快的進行固定，有條件的應將其剖開，早取材，早固定。

II、組織脫水必須徹底乾淨

組織塊取材不能太大過厚，才能較好地完成脫水的過程。如果取材太厚，在較短的時間內脫水不完全，將可引起一系列的問題，比如浸蠟不徹底，切片不好完成，切不完整。由於先天不足，導致後來切片染色的脫落，造成染色的失敗，或者由此反覆操作，造成人力物力的浪費，造成病理報告的延期發出等。因此，對取材的要求是除了要求要有藝術性外，即平整、外觀好看，還要求適中。

III、切片必須完整、均勻、平展、無皺摺、

應用於免疫組織化學染色的切片，對切片的質量要求較高，切片必須完整，平展、無汽泡，無鄒折，這樣有利在染色時的沖洗，有利於切片的牢固附貼。如果切片不平展，免疫組化染色后，可出現染色不均勻的現象，顏色深淺不一，不平。如果切片有汽泡切片在烘烤時，由於汽泡的破裂影響了汽泡周圍的組織，在其周圍可觀察到深淺不一的染色。如果切片有鄒折，免疫組化染色后，在鄒折的地方有深淺不一的顏色，這是一種假陽性，容易引起混淆。

IV、切片的附貼必須牢固，必須使用合適的粘貼劑。

免疫組織化學染色前的前期準備工作，就是必須對新的載玻片進行處理，新的載玻片表面看起來很乾凈，有人認為不需要進行任何的處理，都能夠適合使用，這是一種錯誤的想法。新出廠的載玻片，表面復蓋著開一層油脂樣的物質，如果不加以處理，對切片的附貼是極為不利的。我們的做法是：新的載玻片，放於玻璃清洗液中浸泡4小時甚至過夜，然後取出，經自來水徹底沖洗后，浸入酒精中達2小時以上，取出擦乾備用或烘乾也可。然後再將載玻片浸入了－氨基－三乙氧基－硅烷（3－Aminopropyl triethoxy-silane）的稀釋液（1：50用丙酮或無水乙醇稀釋都可以）中硅化10分鐘，后經無水乙醇洗2次，烘乾即可使用。

V、切片必須烘烤附貼牢固，既要經得起抗原修復時高溫的作用而不使輕易脫片，又不至於破壞抗原。

應用於免疫組化染色的切片。由於整個過程需經幾個階段的處理，如抗原修復時抗原修復液的沸騰且需持續十幾分鐘，PBS的反覆沖洗，有的甚至於4℃冰箱中孵育達十幾小時。因此，對切片的質量要求很高，尤其是切片的附貼程度。以往有人主張切片在60℃以下烘烤30-60分鐘即可按此進行結果是切片掉片嚴重，切片鬆動率佔100%。切片究竟烘烤多長時間才合適，既不脫片和適合各項要求，又不至於破壞抗原。幾組實驗[]診斷P173認為，切片在60℃的恆溫乾燥箱中烘烤2-5小時最為合適。這是因為：抗原可耐受如此的溫度，病理科一般使用的石蠟，其熔點在60℃左右，組織浸蠟時，浸蠟箱中的溫度，一般都調在65℃左右，組織在這樣溫度中要浸泡2小時以上，才能達到徹底地浸蠟。組織中的抗原已經受了65℃的溫度考驗，保存下來的抗原，都已具有耐熱性。另外，經上述時間烘烤出來的切片，附貼牢固，抗原保存好，染色成功率達100%，保證了病理診斷的及時性和準確性。

特需要注意的是，不管是應用於診斷的切片還是研究用的切片，烘烤后應儘快進行染色。如果切片切完后，遲遲不進行染色，存放於室溫中或工作冰箱中，切片中的抗原將會隨著時間的延長而逐漸消失，甚至出現假陰性。原則上是新鮮切片，即行染色，染多少張切多少張，這樣才能儘可能的保存表達更多的抗原。

VI、切片脫蠟必須乾淨，否則將會影響免疫組化染色的最後結果。

蠟不溶於水，不與其它的臨床使用的抗體相融合。它只能靠特用的試劑，處理足夠的時間，才能將其除去。如果脫蠟不幹凈，少許蠟存留於切片上，將會引起許多弊病，如染色不均勻，陽性物時隱時現，真假難辨，背景染色增加等。為了解決上述的問題，切片在染色前必須徹底脫蠟，目前用於脫蠟的試劑主要是二甲苯，因它脫蠟力強，脫蠟時間較短。較受使用者的青睞。脫蠟的時間要根據季節，室溫和試劑的新鮮程度採用不同脫蠟時間。如果在夏天，室溫較高，脫蠟試劑也新鮮，則脫蠟時間不需很多，3-5分鐘就已足夠。如果在冬天，室溫較低，脫蠟試劑也較陳舊，則脫蠟時間需要延長，10-20分鐘或更長。總之，操作時應根據不同的季節，不同的室溫，不同的試劑來決定脫蠟的時間，原則上是要徹底，乾淨，完全地脫去切片上的蠟。為了做到這一步，切片在脫蠟前的加溫將有助於完成上述的要求。比如：當天切的切片，燒烤2小時後進行染色，切片帶有溫度進行脫蠟這將可加速脫蠟的過程，如果預先切好烤好的切片，在染色前，還必須對切片進行加溫10-20分鐘，然後再行脫蠟，這樣脫蠟速度加快，效果也會更好。

VII、必須徹底抑制內源性過氧化物酶的活性，才能降低背景的染色。

在各種組織中都含有很多的內源性過氧化物酶，尤其在紅細胞，中性粒細胞，單核細胞嗜酸性細胞，出血的組織壞死的組織等等。含有這種酶的各細胞和組織如果在染色前不對其進行處理和抑制，它們將會在DAB底物的顯色時，與HRP一樣催化底樣，使之顯色，使之生成與陽性物一樣的黃棕色，造成混亂。為止，在免疫組化染色前，都必須對內源性過氧化物酶進行抑制。當然，對它們進行徹底的消除是不行的，因為抑制太厲害，對抗原也會有相同的抑制作用。氫在抑制內源性過氧化物酶時，也要注意對抗原的保護，抑制也只能針對它們中的大部分，在DAB顯色后，顯示出淡黃色，這就足以與真正陽性物區別。抑製劑常用的是0.3%的H2O2，也可將其稱為1%H2O2，因為市售的H2O2的濃度為30%，按其凈含量則為0.3%，如果按其溶液的用量則為1%。

關於H2O2的使用，有的使用是單純的H2O2稀釋溶，有的使用是H2O2甲醇混合物。根據實驗，認為H2O2甲醇較適合於大多數的情況，因為除了H2O2外，甲醇對各種酶，都有鈍化的作用，因此H2O2甲醇的雙重作用效果較好。陳尚平等認為在多數情況中，用甲醇H2O2已經獲得令人滿意的結果。

VIII、須適當合理地使用封閉試劑

為了減少背景產生的非特異性染色，在免疫組化染色的過程中，在加入一抗孵育前，常常加入非免疫動物血清，以減少背景的染色，陳尚季等認為：抗體是高度的電荷分子，可能與帶有相應電荷的組織成分無特異性地結合（如膠原）。由於這種非特異性結合，將導致標記的部分局部化（軛合物）和膠原的假陽性染色。要用一種不相干的抗體居先處理，可能減少和標記的抗體無特異性結合。

以往，血清的使用有很多，如：小牛血清，馬血清，山羊血清，綿羊血清，兔血清，濃度也有很多種，如：1%.2%.或1：5、1：10、和1:20.

必須選擇合適的抗體以及對作適當的保存和配製。

VVI、選擇合適的抗體

至今為止，應用於臨床的常用抗體有幾十種，在這當中又可分為兩種類型。

根據近幾年來使用的情況認為，它有許多優點，但也有許多不足之處：

①可作為各種疾病檢測的常備抗體。在各單位的常規活檢診斷中，有常見的病例，也有罕見的病例，尤其是後者，有時很長時間才遇到一例，這就給抗體的應用和備用提出了更高的要求，如除了常用的抗體外，還需備用一些較為罕見病例的抗體。這樣才能解決臨床的診斷問題，如臨時購買，則需較長的時間，這樣就會延誤診斷。實踐證明：濃縮型抗體，可作為常備檢測抗體。當購買抗體后，根據檢測病例的數量，在無菌的條件下，將抗體分成小包裝，然後用蠟膜封起來，於－30℃的低溫冰箱中保存，臨用時取出一支，用指溫促其回升至室溫，然後用PBS稀釋即可使用，這種抗體可保存3年左右。

②成本低，價格較便宜。

它與即用型的抗體相比較，價格要便宜好多，如以某公司2002年-2003年的CK為例，濃縮型的抗體0.1ml，價格260元，該抗體可稀釋為5000ml，以每張切片所需抗體為50ul計，可標記100例，每例一抗體所需2.6元，而即用型抗體1.5ml，價格150元，可標記30例，每例一抗體需5元。

③需要稀釋抗體，手續較為複雜。

對於新購入的濃縮型的抗體，使用時必須將稀釋為工作液，才能使用，對於從未用過的抗體，還必須實驗其實際的稀釋度，因為各種抗體，廠家都做了相應的稀釋度的實驗，但這是大概的稀釋度，要使抗體真正適合於本單位的稀釋度，就必須對抗體的稀釋度進行實驗，如1:100.1:75.1:50.1:25等，如果結果在1：50上是最佳結果，這就是最佳的稀釋點，如果在這範圍內找不出最佳稀釋點，則應繼續實驗直到找出最佳稀釋點為止。

④需要配置各型號的微量加樣器，以利於量取精確的抗體量。

⑤需要具備一定的英語水平，因為濃縮型的抗體多為進口試劑，其使用書都以英文為主，其中涉入抗體的來源，適應讓稀釋對什麼組織或細胞可起反應等。

近幾年來，免疫組化技術應用的推廣，即用型抗體的應用越來越受到人們的歡迎，根據幾年來的使用，認為它有許多優點和不足：

①使用方便。對於初學者來說，它是一種最好的抗體，不管什麼樣的病例和切片，只要有抗體，不需要自己摸索稀釋度，拿起試劑瓶一滴即可，極不方便。

②對於不具備或基本不懂免疫組化技術的人，只要按照說明書的方法使用，也能獲得理想的結果。

③不需要配置多種昂貴的微量加樣器。現今的微量加樣器，如為進口貨，貴者多達兩千多元。而即用型抗體無需再行稀釋，即買即用，無需配備其餘器械。

④特別適合於基層單位。基層單位，無需多大的投資，就能開展免疫組化的工作，這對於提高診斷的準確率，極有好處。

⑤價格較濃縮型抗體貴。

⑥即用型抗體不可作為常備貯存抗體。即用型抗體，一般有效期為一年。如果用量大的單位，對於3ml一個包裝的抗體，一年需要用幾支，這對抗體來說，不會造成浪費。但如果為較小的單位，一年中標記的病例較少，購買抗體時也盡量選小包裝的抗體，如1.5ml。如果碰上罕見的病例，有時一年也標記不了幾例，這樣就應採用濃縮的了。即用型的抗體，有效期為一年，但真正購買到的抗體使用期就不可能為一年，因為抗體從生產商到銷售商的手裡，需要一定的時間，如果運氣好的話，你購買到的抗體，是剛交到銷售商的手裡，那麼，使用的時間可能長些，但如果在銷售商的手中滯留了一段時間，抗體的有效使用期就可能不會太長，五個月、六個月或者三個月。如果在有效的時間內不能使用完。稍為超過一些時間還可以，如果時間過長，就應當丟棄，因為會影響標記的質量。有人抱怨，剛買的抗體標記很好，後來就漸漸不好了。這是因為隨著時間的延長，抗體的活性會逐漸失去生物活性，導致了標記質量的下降。

在眾多的抗體中，按它們的實際使用範圍，把它們分為兩個類：

1. 適合於冰凍切片，塗片，細胞培養片。

2. 適合於石蠟切片，冰凍切片，塗片和細胞培養片。

抗體除了分為上述的兩個類外，從其克隆的高度講，也有單克隆和多克隆之分。

1.單克隆抗體，在目前臨床常用的抗體當中，大部分都是單克隆抗體。這要歸功於生物技術的不斷提高。在早些時候，應用於臨床的抗體，大多數為多克隆抗體。

2. 多克隆抗體，在臨床應用的抗體中，還有少部分的抗體為多克隆抗體。

這看似很簡單的問題，如果處理不好也可導致不同的結果，如果應用自動免疫組織化學染色儀，將程序輸入即可，如為手工操作，就必須注意以下的問題：

1. 當PBS沖洗完畢后，在加入抗體，如一抗，二抗或三抗。必須將存留於切片上的多餘的PBS摔干，但不能讓切片乾涸，切片乾涸，往往可產生非特異性染色，切片上PBS存留過多，將會稀釋加入的抗體，影響加入抗體的濃度，同時也將影響最後的結果，如假陰性等。

2. 加入的抗體以一滴為佳。

當擦乾組織塊周邊多餘的PBS后，切片保持著一定的濕潤度，此時加入另外的抗體為最佳時候，滴入抗體以一滴50μl為好，加入后，輕微地搖勻地覆蓋於切片上，使最後的結果穩定均衡，不至於有的地方有反應，有的地方無反應。

3. 切片沒擦好將會影響加入抗體的質量，切片沒沖洗乾淨，沒擦試好，當加入抗體后，它可縮於切片的一邊，此時你為了使加入的抗體能夠完全地覆蓋整個切片，便會使勁地加入抗體，此時的結果是，抗體依然滑向一邊，或者完全露出，這不光沒達到目的，還浪費抗體，正確的做法就是徹底地用PBS沖洗，摔干切片擦乾切片周邊的PBS，再滴入一滴抗體輕輕搖勻即可。

第一抗體的孵育時間，有較多的使用範圍，應用於臨床檢測抗體的孵育時間。一般室溫下孵育在30-60分鐘，120分鐘，對於研究性質的抗體孵育時間，也可按照上述的時間，但也有人提出於4℃冰箱中過夜孵育，根據我們的經驗一般不主張於4℃冰箱中過夜，原因是：

1.長時間的孵育可以使一些非特異性的物質沉澱下來，或者被吸附，造成背景的染色。

2.目前銷售的抗體，純度較高，特異性較強，不需要長時間的孵育，也能夠結合得很好。

3.長時間的孵育，較容易引起切片的脫落，造成染色的失敗。

4.長時間的孵育，不利於臨床病理報告的發出。

X、連接抗體的選用必須正確，否則可造成假陰性的現象。

免疫組化染色方法較多，如ABC法，SP法和EV二步法等，如果使用的是SP法，或者ABC法，這時就必須要仔細地選擇好連接抗體，第一抗體有單克和多克隆炎分，連接抗體則要根據選用的抗體來進行，例如：第一抗體選用的是單克隆鼠抗人**抗體，連接抗體也要選擇相應的免抗鼠IgG，這樣才能連接上（目前生產廠家已生產出混合型抗體，即既適合於單克隆抗體，也適合於多克隆抗體。使用者不用擔心連接不上，隨便使用都可，但如果沒有訂購混合型的試劑盒，就必須注意的型號，使之完全適合所選用的抗體。）孵育的時間可在10分鐘，20分鐘或者30分鐘，一般在室溫中進行，如果室溫低於20℃以下，則可在37℃的孵育箱中進行。

XI、複合物的使用及孵育時間的確定。

各種方法有各自的複合物，如ABC法，複合物是卵白素和生物素結合的複合物，再帶有HRP，SP法，（LsAB法）的複合物是鏈雪菌素蛋白複合物，再帶有HRP，EV二步法的複合物則是二抗和三抗連接在一起的複合物，再帶上HRP，除此之外，根據水解底物的不同，可產生不同的顏色，例如：帶有HRP的酶，水解的底物一般為DAB產生黃棕色，帶AP的酶，水解的底物一般為AEC產生紅色。

XII、PBS的沖洗

免疫組化的染色過程，除了前面的處理和加入的抗體外，都在PBS的沖沖洗洗中度過，PBS沖洗的正確與否，也是導致最後結果的關鍵。

1.單獨沖洗，防止交叉反應造成污染。

臨床上每天檢測的病例很多，所用的抗體種類及項目也多，如果在加入一抗孵育完后，將它們在一個缸內洗，這樣就會造成交叉污染，影響最後的結果。正確的做法是單獨地進行沖洗，沖洗的PBS為一次性，保證切片沒有相互交叉污染的機會。

2.溫柔沖洗，防止切片的脫落。

沖洗切片，取出切片，將PBS從上輕輕地沖洗，讓PBS自上而下流下來，不要拿起切片將PBS對準切片沖洗，這樣由於衝出的PBS有一定的衝擊力，很容易使切片周邊引起鬆動，導致切片的脫落。

3.沖洗的時間要足夠，才能徹底洗去結合的物質。

沖洗切片有人提出用微振蕩器振染，振下未結合的各種物，使之不產生背景，此種做法一是浪費時間，二是很容易導致切片的脫落。切片的沖洗據實踐認為，用一小燒杯柔和地於切片上沖洗，就能徹底沖洗去未結合的物質，無需附加其它條件，沖洗好於切片上再注入PBS，持續2分鐘左右就完全足夠了。

4.PBS的PH和離子強度的使用和要求。

劉彥仿指出：中性及弱鹼性條件（PH7－8）有利於免疫複合物的形成，而酸性條件則有利於分解；低離子強度有利於免疫複合物的形成，而高離子強度則有利於分解。[]免疫組化P56我們目前常用的PBS的PH在7.4-7.6濃度是0.01M，根據本室十幾年來的使用情況，認為該溶液價格便宜配製方面，使用效果好。

5.常用試劑的配製和使用。

在免疫組織化學的染色過程中，用得最多的試劑就是緩衝液，因為切片在整個染色中，抗體的加，換，切片的沖洗，DAB的配製都離不開緩衝液。可見緩衝液在整個染色中都起至關鍵的作用，緩衝液的過酸或偏鹼，都將影響染色的結果。下面將介紹有關方面的內容：

1.磷酸鹽緩衝液（Phosphate buffer solution.PBS）

Ⅰ液：0.2M　Na H2PO4貯存液（PH7.6）

取一個具500ml的容量瓶，稱量15.60g NaH2PO4﹒12H2O倒入瓶中，加入少量蒸餾水使勁搖晃，直至溶解，加入蒸餾水湊足500ml。放於4　冰箱保存，配製時應注意的事項：

①在配製時，要先確定NaH2PO4的用量，因為該試劑有許多種類形，它們所含的水分子量不一樣，因而它們的用量也不一樣。如Na H2PO4含單個水分子時，配製時要稱取13.80g，而當含有2個水分子時，則需要稱取15.60g。

②配製時根據要求選取蒸餾水。因為蒸餾水有數種，單蒸餾水，雙蒸餾水，玻璃蒸餾水，去離子水。如沒特別要求，選用一般的蒸餾水配製則可。

③裝緩衝液的瓶子須用玻璃浸洗液泡洗過，以防污染，導致溶液中有雪菌生長。

Ⅱ液：0.2M NaHPO4貯存液(HP7.6)

取500ml的容量瓶，稱好17.91g NaHPO4﹒12H2O,倒入瓶中，邊加水邊攪拌，直至完全溶解再湊足500ml，貯存於4℃冰箱。

①該試劑也應注意有多種不同的含水分子量。

②該貯存液久放后可出現結晶。每次使用前，先取出回至室溫，搖晃其結晶溶解，也可用微波爐促其快速溶解，然後再用。

0.01M PBS工作液的配製：

取一2000ml的容量瓶一個，裝入已稱好的NaCt18g，加入少量蒸餾水讓其徹底溶解，再加入 Ⅰ液13ml，Ⅱ液87ml，加蒸餾水湊足2000ml，即可使用，即可使用該溶液在室溫下可保存3-4周，但以新配為佳。

PBS工作液配製完畢后，都要測其PH值，如果偏酸，可用氫氧化鈉來調試，如果偏鹼可用HCl調試，測試有如下n種方法：

①PH測試筆測試，這是一種簡便、易行、結果較為準確的測試方法。當配製完PBS后，取一小杯，倒入配好的PBS，插入測試筆，打開開關，小屏幕上將可出現測出的PH結果。PH如果7.6不足，小量的可用0.2M Na2HPO4調校，大量的可用氫氧化鈉調校。PH如果高於7.6，小量的用0.2M NaH2PO4調校，大量的可用HCL來調校。

②用試紙來測試：PH試紙有兩種，一種為廣泛PH試紙，範圍在1-14，另一種是精密試紙有各種各樣的範圍。但是，作為沖洗切片用的PBS，其精確度不需要十分精確，如配PH7.6時，測試時在PH7.5或7.7，都可使用。試紙測試PH值，停靠其反應的顏色來確定，十分簡便，一般的試劑都可用它來測試。

③儀器測試：對於要求較高，需較準確的PH值，須彩用儀器測試。

1. Tris緩衝溶液(Tris buffer solution,TBS)

①1N HCL ，濃HCL(雙重1.19)8.3ml，先取50ml蒸餾水，加入HCL再加水到100ml。

②0.5M Tris-HCL緩衝液(PH7.6)

取Tris(羥甲基氨基甲烷)6.57g，加入少許的蒸餾水攪拌，直至溶解，再加入1N HCL42ml，然後用蒸餾水湊足100ml，於4℃冰箱保存。

臨用時，將上述溶液10稀釋倍，即為0.05M工作液。

配置HCL溶液注意事項：

①配製1N HCL時，如果大量配製，HCL入水時可產生很大的熱量，對的所用的玻璃器皿應特別小心，以防突然產熱而使玻璃器皿爆裂。

②調校PH值時，可參考上述的三種方法。