SYBR Green I

SYBR Green I是高靈敏的DNA熒光染料，適用於各種電泳分析，操作簡單：無須脫色或沖洗。至少可檢出20pg DNA，高於EB染色法25-100倍。SYBR Green I 與dsDNA 結合熒光信號會增強800-1000倍，用SYBR Green I染色的凝膠樣品熒光信號強，背景信號低。可適用於多種電泳分析。

SYBR Green I 適合於多種凝膠電泳方法：瓊脂糖凝膠，聚丙烯醯胺凝膠電泳，脈衝電場凝膠電泳，和毛細管電泳等。

SYBR Green I 與雙鏈DNA的親和力非常高，因此可以用做電泳前染色，對分子生物學中常用的酶（如：Taq 酶、逆轉錄酶、內切酶、T4連接酶等）沒有抑制作用。另外，SYBR Green I 與EB相比，誘變能力大大降低。

SYBR Green I 核酸凝膠染液(SYBR Green Nucleic Acid Gel Stains)是一種高敏感性的熒光染液，用於檢測瓊脂糖凝膠及聚丙烯醯胺凝膠中的雙鏈DNA和寡核苷酸。當染液與核酸結合后，SYBR Green I 核酸凝膠染液的熒光信號會明顯增強，因此經SYBR GreenI 核酸凝膠染液染色的凝膠顯示出非常好的信噪比，沒有背景熒光。為獲得最佳的結果，凝膠最好在跑膠后再進行染色。SYBR GreenI 核酸凝膠染液用於低含量的PCR產物，凋亡研究及異源雙鏈分析中少量DNA的檢測較為理想。可應用於：DNA和RNA的檢測；SSCP及異源雙鏈分析。

高靈敏：至少可檢出20pg DNA，高於EB染色法25-100倍。

信噪比高：樣品熒光信號強，背景信號低。

操作簡單：無須脫色或沖洗。

適用範圍廣：可適用於多種電泳分析。

使用方便：不影響其它修飾酶作用。

經濟：價格比銀染便宜。

1. 該方法適用於瓊脂糖凝膠電泳和PAGE凝膠電泳

2. 工作液的配製：用電泳緩衝液將10000×的SYBR GreenⅠ稀釋100倍，即為SYBR GreenⅠ工作液。SYBR GreenⅠ工作液可以置2-8℃冷藏一個月以上。

3. 制膠：按常規方法制膠，不含任何染料。

4. 樣品染色：向分析樣品中加入SYBR GreenⅠ工作液和載樣緩衝液，室溫放置10分鐘，使SYBR GreenⅠ與樣品中DNA充分結合。SYBR GreenⅠ工作液加入量為總上樣量的1/10。

5. DNA Marker染色：將5μL DNA Marker和1μLSYBR GreenⅠ工作液混勻，室溫放置5分鐘，使SYBR GreenⅠ與DNA充分結合。

6. 上樣、電泳：按常規操作。

7.檢測：用ABLUe可見光核酸檢測儀器檢測

1. 按照常規方法進行電泳。

2. 用PH 7.0 - 8.5 的緩衝液（如：TAE，TBE 或 TE），按照10000：1的比例稀釋SYBR GreenⅠ濃縮液，混勻，製成染色溶液。

3. 將染色溶液倒入合適的聚丙烯容器中，放入凝膠，用鋁箔等蓋住容器使染料避光。室溫振蕩染色10-30分鐘，染色時間因凝膠濃度和厚度而定。聚丙烯醯胺凝膠直接在玻璃平皿上染色，將配好的工作溶液輕輕地倒在膠板上，讓工作液均勻地覆蓋整個膠板，並染色30分鐘。玻璃平皿必須預先經過硅烷化溶液處理（避免染料吸附在玻璃表面上）。

4. 用ABLUe觀測。藍光可透過玻璃，觀測聚丙烯醯胺凝膠時，可直接將托有凝膠的玻璃平皿放入ablue內觀測。

1. 在"SYBR GreenⅠ預染色方法"中，電泳時間不要超過2小時，否則SYBR GreenⅠ會從DNA上分離出來，會產生彌散狀條帶。

2. 在常規用酒精沉澱核酸的過程中，SYBR Green I可以全部從雙鏈核酸上去掉。

3. 如果想對用SYBR Green I染過的膠進行 Southern blots，建議在預雜化和雜化溶液中加入 0.1%- 0.3% 的SDS。

4. 在紫外照射透視下，與雙鏈DNA結合的SYBR Green I呈現綠色熒光。如果膠中含有單鏈 DNA 則顏色為橘黃而不是綠色。

5. SYBR Green對玻璃和非聚丙烯材料具有一定親合力。建議在稀釋、貯存、染色等使用過程中用聚丙烯類容器。

1實驗方法

囊腔組織經液氮速凍后，放入-70℃冰箱保存備用。Real-time PCR法檢測EMMPRIN的mRNA含量。

1.1組織總RNA提取：

（1）從液氮中取出組織，用已處理過的剪刀剪取約100mg組織塊，加入1ml Trizol試劑，轉移至勻漿器中，將勻漿器置於冰水上充分研磨，轉移研磨好的勻漿液至無RNA酶/無DNA酶的1.5ml離心管中，室溫下靜置5min。

（2）加入0.2ml氯仿，顛倒混勻10次充分混勻，室溫下靜置2-5min，4℃狀態下進行離心，離心速度為12000r/min，離心時間10min；

（3）小心吸取上層水相溶液至另一無RNA酶/無DNA酶的1.5ml離心管中，小心吸取上層水相，勿碰及或吸走中間層，否則要重新離心再吸取（可吸取約0.4-0.5 ml）。

（4）加入等體積異丙醇，顛倒混勻后室溫下靜止15min，4℃狀態下進行離心，離心速度為12000r/min，離心時間15min。小心棄上清，沿管壁加入1ml 75%乙醇（DEPC水配置，預冷），室溫下靜置1min，4℃狀態下離心，速度7500r/min，離心時間5min；小心倒掉上清，再4℃狀態下離心，速度3500r/min，時間離心1min；離心後用10μl槍頭小心吸去殘餘液體，最後用30μlDEPC-H2O溶解RNA。

（5）提取的總RNA經紫外分光光度計測定，提取物濃度OD 260/280比值在1.8-2.0之間。

1.2逆轉錄反應：

用上述細胞中提取的2μg總RNA在下述20μl反應體系中逆轉錄成cDNA,該反應體系組成如下：5×RT-Buffer 4μl, oligd(T) 2.5μmol/L, dNTPs 5mmol/L, RNA酶抑製劑（RNAsin) 20U。首先70?C預變性5min，然後加入逆轉錄酶MMLV 200U，再於42?C孵育1h，72?C加熱10min滅活逆轉錄酶。

1.3 Real-time PCR 反應：

1.3.1 方法學確認 根據引物相關信息PCR擴增，PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析並且對其純化，假設純化所得DNA濃度為a×10x，對其做10倍梯度稀釋7次，稀釋濃度依次為a×10x-1、a×10x-2、a×10x-3、a×10x-4、a×10x-5、a×10x-6、a×10x-7選擇合適稀釋品作為標準品模板。

1.3.2 取上述逆轉錄反應產物於20μl反應體系中進行PCR反應。PCR引物由上海之江生物科技有限公司合成。

PrimerSequence (5′to 3′)Length（bp）

GAPDH Forward primer5'-GTCGGTGTGAACGGATTT-3'276

GAPDH Reverse primer5'-ACTCCACGACGTACTCAGC-3'

EMMPRINForward primer5’- TGGCCTTCACGTTCCTGAGT -3’215

EMMPRINReverse primer5’ - GTCATCTGCATCCACCGTGT-3’

反應體系組成如下：10×Buffer（2μl）、dNTP 10 mmol /L(0.4μl)、MgCl2 25mmol/L (1.6μl)、5U TaqDNA多聚酶(0.3μl)、模板2μl、上、下游特異引物各0.25μl、去離子水16.2μl。

按下述熱循環參數運行：GAPDH內參照基因；預變性：94×2min；變性：94×2s，退火56×15s，延伸72×15S（採光）共30個循環。EMMPRIN基因；預變性：94×2min；變性：94×2s，退火58×15s，延伸72×12s （採光）共35個循環。以SLAN軟體分析並計算目的基因EMMPRIN與GAPDH的Ct值。

2 實驗結果

2.1內參照基因、目的基因瓊脂糖凝膠電泳結果：隨機選擇3份標本PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，在理論片段大小位置有單一條帶且無雜帶和引物二聚體。

2.2 試劑擴增效率驗證：經過對標準品定量，內參照基因GAPDH擴增檢測Ct值與濃度對數值的相關係數為0.99996，目的基因EMMPRIN擴增檢測Ct值與濃度對數值的相關係數為0.99969。內參照基因和目的基因皆有良好的擴增效率（相關係數>0.98）。可用ΔCt發行數據統計。