印跡雜交

印跡雜交

印跡雜交，是基因診斷技術的一種，有多種方式，第一種是Northern印跡雜交，是一種將RNA從瓊脂糖凝膠中轉印到硝酸纖維素膜上的方法。第二種是Southern印跡雜交，是由凝膠電離經限制性內切酶消化的DNA片段。第三種是Western印跡雜交，是將蛋白樣本通過聚丙烯醯胺電泳按分子量大小分離，再轉移到雜交膜（blot）上，然後通過一抗/二抗複合物對靶蛋白進行特異性檢測的方法。

Northern雜交用於分析RNA；Southern雜交用於分析DNA；

Western雜交用於分析蛋白質。

大致過程如下：

(1) 酶切DNA，凝膠電泳分離各酶切片段，然後使DNA原位變性。

(2) 將DNA片段轉移到固體支持物(硝酸纖維素濾膜或尼龍膜)上。

(3) 預雜交濾膜，掩蓋濾膜上非特異性位點。

(4) 讓探針與同源DNA片段雜交，然後漂洗除去非特異性結合的探針。

(5) 通過顯影檢查目的DNA所在的位置。

Northern雜交

主要用於分析RNA，包括正向雜交、反向雜交、斑點雜交。

正向Northern雜交是將待測RNA固定在纖維膜上，用特異序列DNA探針與其雜交，再顯影觀察。

反向Northern雜交是將特異序列DNA固定在纖維膜上，用待測RNA做成探針與其雜交，再顯影觀察。

Southern雜交

主要用於分析DNA，也包括正向雜交、反向雜交、斑點雜交。

正向Southern雜交是將待測DNA固定在纖維膜上，用特異序列DNA探針與其雜交，再顯影觀察。

反向Southern雜交是將特異序列DNA固定在纖維膜上，用待測DNA做成探針與其雜交，再顯影觀察。

Western雜交

主要用於分析蛋白質，利用了抗原抗體特異性結合的原理。分為抗原法、夾心法、競爭法。

抗原法是將待測抗原固定在膜上，加特異抗體與其結合、洗膜、顯色、觀察。

夾心法是將一抗固定在膜上，加待測抗原、洗膜、加特異二抗、洗膜、顯色、觀察。

競爭法是分對照和試驗兩組，對照組將特異抗原固定在膜上，實驗組將待測抗原固定在膜上，都加入特異抗體，顯色、觀察。用於比較抗原的特異性。

Northern印跡雜交

Northern印跡雜交（Northern blot）。這是一種將RNA從瓊脂糖凝膠中轉印到硝酸纖維素膜上的方法。DNA印跡技術由Southern於1975年創建，稱為Southern印跡技術，RNA印跡技術正好與DNA相對應，故被稱為Northern印跡雜交，與此原理相似的蛋白質印跡技術則被稱為Western blot。

Northern印跡雜交由Southerm印雜交法演變而來，其被測樣品是RNA。經甲醛或聚乙二醛變性及電泳分離后，轉移到固相支持物上，進行雜交反應，以鑒定基因中特定mRNA分子的量與大小。該法是研究基因表達常用的方法，可推敲出癌基因的表達程度。

Southern印跡雜交

Southern印跡雜交（Southern blot）1975年由英國southern創建。

英文解釋：use a DNA or a RNA probe to hybridize with DNA from a genome to detect whether there is/are the homologue DNA.

Southern印跡雜交是由凝膠電離經限制性內切酶消化的DNA片段，將凝膠上的DNA變性並在原位將單鏈DNA片段轉移至硝基纖維素膜或其他固相支持物上，經干烤固定，再與相對應結構的已標記的探針進行雜交反應，用放射性自顯影或酶反應顯色，檢測特定大小分子的含量。可進行克隆基因的酶切圖譜分析、基因組基因的定性及定量分析、基因突變分析及限制性長度多態性分析（RELP）等。

Western印跡雜交

蛋白免疫印跡雜交（Western Blot WB）是將蛋白樣本通過聚丙烯醯胺電泳按分子量大小分離，再轉移到雜交膜（blot）上，然後通過一抗/二抗複合物對靶蛋白進行特異性檢測的方法。WB是進行蛋白質分析最流行和成熟的技術之一。

Northern印跡雜交的RNA吸印與Southern印跡雜交的DNA吸印方法類似，只是在進樣 前用甲基氫氧化銀、乙二醛或甲醛使RNA變性，而不用NaOH，因為它會水解RNA的2'-羥基基團。RNA變性後有利於在轉印過程中與硝酸纖維素膜結合，它同樣可在高鹽中進行轉印，但在烘烤前與膜結合得並不牢固，所以在轉印後用低鹽緩衝液洗脫，否則RNA會被洗脫。在膠中不能加EB，因為它會影響RNA與硝酸纖維素膜的結合。為測定片段大小，可在同一塊膠上加分子量標記物一同電泳，之後將標記物切下、上色、照像，樣品膠則進行Northern轉印。標記物膠上色的方法是在暗室中將其浸在含5μg/ml EB的0.1mol/L醋酸銨中10min，光在水中就可脫色，在紫外光下用一次成像相機拍照時，上色的RNA膠要儘可能少接觸紫外光，若接觸太多或在白熾燈下暴露過久，會使RNA信號降低。瓊脂糖凝膠中分離功能完整的mRNA時，甲基氫氧化銀是一種強力、可逆變性劑，但是有毒，因而許多人喜用甲醛作為變性劑。所有操作均應避免RNase的污染。RNA甲醛凝膠電泳和吸印方法。

10×MSE緩衝液：0.2mol/L嗎啉代丙烷磺酸（MOPS），pH7.0，50mmol/L醋酸鈉，1mmol/L EDTA pH8.0。

5×載樣緩衝液：50%甘油，1mmol/L EDTA，0.4%溴酚藍。

甲醛：用水配成37%濃度（12.3mol/L），應在通風櫃中操作，pH高於4.0。

20×SSC；

去離子甲醯胺；

50mmol/L NaOH(含10mmol/L NaCl)；

0.1mol/L Tris，pH7.5。

40ml水中加7g瓊脂糖，煮沸溶解，冷卻到60℃，加7ml10×MSE緩衝液，11.5ml 甲醛，加水定容至70ml，混勻后倒入盛膠槽。

等膠凝固后，去掉梳子和膠布，將盛膠槽放入1×MSE緩衝液的電泳槽。

使RNA變性（最多20μg），RNA4.5ml,10×MSE緩衝液20ml，甲醛3.5ml，去離子甲醯胺10ml。

55℃加熱15min，冰浴冷卻。

加2ml5×載樣緩衝液。

上樣、同時加RNA標記物。

60伏電泳過夜。

取出凝膠，水中浸泡2次，每次5min。

室溫下將膠浸到50mmol/L NaOH和10mmol/L NaCl中45min，水解高分子RNA，以增強轉印。

室溫下將膠浸到0.1mmol/L Tris HCl(pH7.5)中45min,使膠中和。

20×SSC洗膠1小時。

20×SSC中過夜轉印到硝酸纖維素膜上。

取出硝酸纖維素膜，80℃真空烘烤2小時。

1．按下述步驟，每泳道加10～20μg總RNA或0.5～1μg poly(A)+RNA進行甲醛/瓊脂糖凝膠電泳，將凝膠放在紫外線透照儀上，旁邊置一標尺進行拍照。

a. 總RNA（10～20μg）用下列溶液在65℃溫育5min：

總RNA（10～20μg） 6.0μl

甲醯胺 12.5μl

10×MOPS緩衝液 2.5μl

甲醛溶液（37%） 4.0μl

b. 置冰浴迅速冷卻，加2.5μl上樣緩衝液，並加樣於按如下配製的甲醛/瓊脂糖凝膠中。

瓊脂糖 1.0g

10×MOPS緩衝液 10.0ml

H2O 73.0ml

c. 加熱至100℃溶解凝膠，然後置50℃水浴箱降溫。加17ml甲醛，混勻並立即倒膠。須在通風櫥內帶手套操作，用一電泳槽專供RNA電泳。

1、當凝膠仍在電泳時，裁一張與凝膠大小相同的濾紙，以20×SSC浸泡。

2、安裝轉移裝置，盤內倒入雜交緩衝液（20×SSC）。在緩衝液平面上做一平台，將凝膠盤倒置，並蓋三張經20×SSC飽和的濾紙（Whatman 3MM），平台兩端的濾紙應浸入緩衝液中，用10ml的玻璃吸管滾動以趕除氣泡並將濾紙推平。

3、在濾紙表面倒入數ml 20×SSC，將凝膠倒扣於濾紙上，小心趕除凝膠與濾紙間的氣泡，凝膠四周用膠布粘貼或用塑料薄膜包裹以防緩衝液直接從凝膠周圍流至紙中（虹吸短路）。

4、用數ml 20×SSC浸沒凝膠，置濾膜於凝膠上，確保凝膠與濾膜之間無氣泡。用軟鉛筆標記面對凝膠的濾膜面。

5、濾膜表面放三張大小與濾膜相似並預先用20×SSC浸泡的3MM濾紙。

6、放一疊乾燥吸水紙（印跡紙或紙巾）在3MM濾紙表面（約5～8cm高）。

7、在摺疊紙上放一玻璃板，並在玻璃板上置0.75～1kg重的物體。

8、轉移進行12～16小時，確保槽內有足夠的20×SSC（約3L）。

9、轉印后，小心拆卸印跡裝置，將凝膠與濾膜一起轉移到乾燥濾紙上，凝膠在上。用軟鉛筆標記凝膠和濾膜加樣孔的位置，撕去凝膠。

10、以20×SSC漂洗濾膜片刻以去除瓊脂糖殘跡。

11、將濾膜放在一塊乾燥的3MM濾紙上稍微晾乾。

12、固定RNA於濾膜上，將尼龍膜RNA面朝下在紫外透照儀照射3～5min。

13、此濾膜可用於雜交或4℃保存，尼龍膜需要塑料袋密封。

印跡雜交

1、用5×SSPE浸濕RNA濾膜。

2、將浸濕的RNA濾膜轉移至塑料袋中，塑料袋四周封口並剪去一角。

3、預熱預雜交液至42℃，經塑料袋開口處加入0.1ml/cm2的預熱的預雜交液，小心移取，避免加入氣泡，從塑料袋中擠壓出所有氣泡，密封塑料袋。

4、在42℃水浴搖床中溫育塑料袋2～4小時，或將塑料袋夾於兩塊玻璃板中置42℃烤箱2～4h，確保濾膜表面無氣泡。

5、至95℃ 10min使探針變形，立即置冰浴冷卻5min。

6、剪去雜交袋一角，將預雜交液倒入15或50ml的Falcon試管中，加入約10～20ng/ml（隨機引物標記）探針，一般來說，106～107cpm/ml已足夠，輕輕混勻。用一次性塑料移液管將雜交液加入裝有濾膜的塑料袋中。

7、從塑料袋的開口處將氣泡全部壓出，用紙巾揩去流出的少許雜交液，小心封好袋口，避免液體漏出。必要的話，可將塑料袋套入另一個塑料袋內以防放射性污染。

8、在42℃水浴搖床中溫育12～16h，或夾在兩塊玻璃板中置42℃烤箱溫育12～16h。

9、雜交完畢，打開塑料袋的一角，將雜交液倒入15或50ml的Falcon試管中。小心不要使放射性溶液濺出。

10、將塑料袋完全打開，用鈍頭鑷子將濾膜轉移至盤中以便清洗，立即用緩衝液（2×SSC，0.1%SDS）1漂洗濾膜。

11、室溫下，用漂洗緩衝液1漂洗三次，每次5min。

12、室溫下，用漂洗緩衝液2（0.25×SSC，0.1%SDS）漂洗兩次，每次5min。

13、用預熱45℃的漂洗緩衝液2漂洗1～3次，每次15min。在更換緩衝液之間，應用蓋革計數器檢測滯留在印跡中心的放射性。

14、充分漂洗后，把雜交膜放在一張3MM濾紙上稍晾乾后，將潮濕的濾膜封在塑料袋內或用塑料薄膜包裹。

15、濾膜放射自顯影：將雜交膜（包裹在塑料袋內，RNA面朝上）放在X射線暗盒底部，膠片放在其上。為方便起見，可將增感屏固定在暗盒蓋上，關閉暗盒，在－70℃曝光1天～2周。

16、將暗盒從冰箱內移出時，應有足夠的時間（30min～1h）使其溫度調至平衡。在暗室將膠片從暗盒取出，並在自動X線底片處理儀上沖洗。

1．煮沸0.1%SDS溶液。

2．把膜放在玻璃盤內，將溶液倒在膜上，涼至室溫。

3．用蓋革計數器檢測降低的活性。

綜述

Southern印跡雜交（Southern blot）是研究DNA圖譜的基本技術，在遺傳病診斷、DNA圖譜分析及PCR產物分析等方面有重要價值。Southern印跡雜交的基本方法是將DNA標本用限制性內切酶消化后，經瓊脂糖凝膠電泳分離各酶解片段，然後經鹼變性，Tris緩衝液中和和高鹽下通過毛吸作用將DNA從凝膠中轉印至硝酸纖維素膜上、烘乾固定后即可用於雜交。凝膠中DNA片段的相對位置在DNA片段轉移到濾膜的過程中繼續保持著，附著在濾膜上的DNA與32P標記的探針雜交，利用放射自顯影術確立探針互補的每一條DNA帶的位置，從而可以確定在眾多消化產物中含某一特定序列的DNA片段的位置和大小。

瓊脂糖凝膠電泳

利用瓊脂糖凝膠電泳可以很容易地將DNA限制酶消解片段（0.3～25kb）分離開，分離大分子DNA片段（800-12000bp）用低濃度瓊脂糖（0.7%），分離小分子片段（500～1000bp）用高濃度瓊脂糖（1.0%），300-5000bp的片段則用1.3%的瓊脂糖凝膠。根據分離樣品品質，分離速度和解析度要求的不同，可選用不同規格的電泳槽。電泳時，同時將分子量標記物加到旁邊孔中，便於確定樣品DNA的分子量。20伏恆壓電泳過夜，電泳完畢，將膠浸到含0.5μg/ml EB的TBE緩衝液中染色30min，也可將EB直接加到電泳緩衝液中或在灌膠前加入膠片中，在254nm短波透射燈下拍照，加橙黃色濾色鏡，使用高速一次成像膠片，光圈f4.5，曝光20-40秒。

硝酸纖維素膜吸印

將膠片切成合適大小，切去右上角作為記號。

將膠片放進盛有變性緩衝液（1.5mol/L NaCl,0.5mol/L NaOH）的盤中輕晃15分鐘。

換到中和緩衝液（1mol/L Tris-HCl,pH8.0,0.15mol/L NaOH）的盤中輕晃30分鐘。

裁一張硝酸纖維素膜、2-4張3mm濾紙和一些吸印紙（可用衛生紙），都與膠的大小相同（硝酸纖維素膜和吸印紙不能比膠大，否則易形成旁路）。先將硝酸纖維素膜浸到水中，再放入10×SSC緩衝液，接觸膠和硝酸纖維素膜時都要戴手套操作。

平盤上放一塊比膠大的平板上面鋪一張3mm濾紙，起燈蕊作用，盤中加入少量10×SSC緩衝液（2.5cm厚），不能沒過平板，使3mm濾紙充分飽和。

將膠倒扣在3mm濾紙上。

浸濕的硝酸纖維素膜在膠上，對齊。鋪膜時從一邊逐漸放下，防止產生氣泡，有氣泡時，可用吸管趕出，不能讓膜與膠下的濾紙直接接觸。

膜上放一張3mm濾紙，不能與膠接觸。

上面加吸印紙及重物（500g左右）。

通過濾紙的燈芯作用，平盤中的緩衝液就會通過膠上移，從而將DNA吸印到膜上，及時更換浸濕的吸印紙，在室溫下轉印過夜。

清除上面的東西。用鑷子將膜取出，在6×SSC中洗一下。

自然乾燥，80℃烤2小時。

這時的膜就可進行雜交，或室溫密封保存。