實時熒光定量pcr儀

實時熒光定量PCR儀+實時熒光定量試劑+通用電腦+自動分析軟體，構成PCR-DNA/RNA實時熒光定量檢測系統。

樣品到達域值水平所經歷的循環數稱為Ct值（限制點的循環數）。域值應設定在使指數期的擴增效率為最大，這樣可以獲得最準確，可重複性的數據。如果同時擴增的還有標有相應濃度的標準品，線性回歸分析將產生一條標準曲線，可以用來計算未知樣品的濃度。

所謂real-time Q-PCR技術，是指在PCR反應體系中加入熒光基因，利用熒光信號累積實時監測整個PCR進程，最後通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。在 real-time 技術的發展過程中，兩個重要的發現起著關鍵的作用：（1）在90年代早期，TaqDNA多聚酶的5′核酸外切酶活性的發現，它能降解特異性熒光記探針，因此使得間接的檢測PCR產物成為可能。（2）此後熒光雙標記探針的運用使在一密閉的反應管中能實時地監測反應全過程。這兩個發現的結合以及相應的儀器和試劑的商品化發展導致real-time Q-PCR方法在研究工作中的運用。

PCR反應過程中產生的DNA拷貝數是呈指數方式增加的，隨著反應循環數的增加，最終PCR反 應不再以指數方式生成模板，從而進入平台期。在傳統的PCR 中，常用凝膠電泳分離並用熒光染色來檢測PCR反應的最終擴增產物，因此用此終點法對PCR產物定量存在不可靠之處。在real-time Q-PCR中，對整個PCR反應擴增過程進行了實時的監測和連續地分析擴增相關的熒光信號，隨著反應時間的進行，監測到的熒光信號的變化可以繪製成一條曲 線。在PCR反應早期，產生熒光的水平不能與背景明顯地區別，而後熒光的產生進入指數期、線性期和最終的平台期，因此可以在PCR反應處於指數期的某一點 上來檢測PCR產物的量，並且由此來推斷模板最初的含量。為了便於對所檢測樣本進行比較，在real-time Q-PCR反應的指數期，首先需設定一定熒光信號的域值，一般這個域值（threshold）是以PCR反應的前15個循環的熒光信號作為熒光本底信號（baseline），熒光域值的預設設置是3～15個循環的熒光信號的標準偏差的10倍。如果檢測到熒光信號超過域值被認為是真正的信號，它可用於定義 樣本的域值循環數（Ct）。Ct值的含義是：每個反應管內的熒光信號達到設定的域值時所經歷的循環數。研究表明，每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數的 對數存在線性關係，起始拷貝數越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數的標準品可作出標準曲線，因此只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標準曲線上計算出該樣 品的起始拷貝數。

⑴ 病原體檢測

目前，採用熒光定量PCR檢測技術可以對淋球菌、沙眼衣原體、解脲支原體、人類乳頭瘤病毒、單純皰疹病毒、人類免疫缺陷病毒、肝炎病毒、流感病毒、結核分枝桿菌、EB病毒和巨細胞病毒等病原體進行定量測定。與傳統的檢測方法相比具有靈敏度高、取樣少、快速簡便等優點。

如：結核菌基因診斷的意義主要表現在：

a.區分TB與其它分枝桿菌；

b.檢測TB耐葯基因；

c.提高TB的陽性檢出率。

⑵ 產前診斷

到目前為止，人們對遺傳性物質改變引起的遺傳性疾病還無法治療，只能通過產前監測，減少病嬰出生，以防止各類遺傳性疾病的發生，如為減少X連鎖遺傳病患兒的出生，從孕婦的外周血中分離胎兒DNA，用實時熒光定量PCR檢測其Y性別決定區基因是一種無創傷性的方法，易為孕婦所接受。

⑶ 藥物療效考核

對乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV) 定量分析顯示：病毒量與某些藥物的療效關係。HCV高水平表達，干擾素治療作用不敏感，而HCV低滴度，干擾素作用敏感；在拉米夫定治療過程中，HBV-DNA的血清含量曾有下降，隨後若再度上升或超出以前水平，則提示病毒發生變異。如PCR技術在HBV檢測中的應用及意義：

a.了解乙肝病毒在體內存在的數量。

b.是否複製。

c.是否傳染，傳染性有多強。

d.是否有必要服藥。

e.肝功能異常改變是否由病毒引起。

f.判斷病人是適合用哪類抗病毒藥物。

g.判斷藥物治療的療效。

⑷ 腫瘤基因檢測

儘管腫瘤發病的機理尚未清楚，但相關基因發生突變是致癌性轉變的根本原因已被廣泛接受。癌基因的表達增加和突變，在許多腫瘤早期就可以出現。實時熒光定量PCR不但能有效地檢測到基因的突變，而且可以準確檢測癌基因的表達量。目前用此方法進行過端粒酶hTERT基因、慢性粒細胞性白血病WT1基因、腫瘤ER基因、前列腺癌PSM基因、腫瘤相關的病毒基因等多種基因的表達檢測。隨著與腫瘤相關的新基因的不斷發現，熒光定量PCR技術將會在腫瘤的研究中發揮更大的作用。

在優生優育中的應用

近年來經濟發展迅猛，人民生活水平逐年提高，對自身及家人特別是下一代的身體健康愈來愈重視。另外，由於國內計劃生育工作逐步走向深化，獨生子女比較多，孩子的身體素質更成為長輩們關注的焦點。因此，怎樣提高新生兒質量改善人類遺傳素質，即優生優育已顯得非常重要。①避免有嚴重遺傳性疾病和先天性疾病的個體出生。②增進體力、智力優秀個體的繁衍。其中避免有嚴重遺傳性疾病及先天性疾病個體出生是優生優育最基本的內容。從臨床優生學角度分析具體工作包括在母親妊娠期間對母親及胎兒進行遺傳學檢查盡量排除常見的遺傳性疾病個體的出生，另外在妊娠期檢查母親是否患有某些易引起胎兒畸形的傳染性疾病如弓型蟲、風疹病毒、衣原體等感染。以往對遺傳性疾病的檢測主要使用染色體分析法，而臨床絕大部分遺傳性疾病是基因病而不是染色體病，染色體發析法不能檢出的。若使用PCR基因擴增法聯合單鏈構型多態性分析（sscp）、限制性片段長度多態性分析（RFCP）等位基因特異性寡核某酸（Aso）點雜交或差異PCR可以很方便地檢出單個基因的突變而且其準確性可達95%以上，因此使這一問題得到了較好的解決。常見的易致胎兒畸形的感染性疾病原體主要有單皰病毒（HSVⅡ）、風疹病毒（RV）、人巨細胞病毒（HCMV）、弓形體（TOX）及沙眼衣原體（CT）。以往這些病原體感染診斷比較困難，主要靠培養法進行確診，而培養法費時，代價昂貴，而且受到採樣、樣本保存及用藥等因素的影響，基本不能在臨床中推廣。PCR基因擴增法因其高敏感性、高特異性非常適合這些疾病診斷及療效跟蹤，是最值得推薦的檢驗方法。

擴增法

在遺傳性疾病產前診斷中的應用

PCR基因擴增法在遺傳性疾病產前診斷中的應用，遺傳病是由於遺傳物變化而引起的機體某一功能或缺陷或異常所致的疾病，其根本變化在於遺傳物質。其類型包括單基因遺傳病，染色體遺傳病及多基因遺傳病。遺傳病診斷除詢問病史，一般物理診斷，普通實驗室檢查及了解癥狀、體征外有特殊性。過去常應用系譜分析，染色體及性染色色質檢驗作為遺傳病診斷的主要依據，再輔以相關的酶學分析從而作出診斷。隨著分子生物不的迅速發展及其在遺傳性病診斷中的廣泛應用，基因診斷技術誕生，基因診斷技術為遺傳病的臨床診斷起了很大的促進作用。聚合酶鏈反應（PCR）技術是基因診斷主要技術之一。這種快速、靈敏的基因體外擴增技術與多種分子生物學手段相配合可以檢出大部分已知的基因突變、基因缺失、染色體錯位等，PCR技術日益成為遺傳病診斷的最有效、最可靠的方法之一。以下舉幾個在國內有普遍意義的例子。

PCR檢測地中海貧血

地中海貧血（Thalassemia）是一種遺傳性慢性溶血性貧血病，是世界上最常見且發病比最高的一種單基因遺傳病。在兩廣、貴州、四川等地發病率較高，在廣西等地高達15%。地中海貧血是由於基因突變造成珠蛋白的不平衡，使結構正常的肽鏈合成量減少甚至沒有合成表現為溶血性貧血。接受累基因種類分為α、β、γ等，其中以 α、β地貧為最常見，危害了最大。珠蛋白基因簇位於人6號染色短臂上，有兩個重複基因基因位於α1、α2、兩個α基因及其旁側序列有很大的同源性，易出現染色體不等交換，導致α基因缺失－α地貧。α地貧基因部分缺失有α1基因部分缺失、α2基因缺失、α1及α2基因同時缺失及非缺失型地貧。可以應用PCR技術擴增α1、α2基因從而檢測這些基因是否缺失、突變等，從而對α型地中海貧血作出診斷。β地中海貧血基因缺陷主要表現為基因序列中單一核苷酸的突變，或少數鹼基的缺失、插入，使正常β珠蛋白肽鏈合成減注或缺失。應用位點特異性寡核苷探針（Aso）進行PCR產物斑點雜交即可對其作出診斷。

苯西酮尿症（PKU）是一種常染色體隱性遺傳病，患者因苯丙酸羥化酶轉化為酷氨酸，使苯氨酸及其代謝物在體內大量蓄積，出現腦組損傷及不可逆性智力發育障礙。PKU患者出生時正常，新生兒一經確診為PKU停止母乳餵養採用低苯丙氨酸欽食療法8—10年，可使患者智力水平發展維持正常。由於低苯丙氨酸欽食非常昂貴，一般家庭難以承受，因此，施行產前診斷，防止患兒出生是最好的選擇。PAH只在肝細胞中表達，不能用血細胞，成纖維細胞、羊水、絨毛細胞進行酶活性分析，只能進行基因診斷。PKU的基因變化並非全部PAH基因的缺失，而是以點突變為主要表現形式，而且其突變位點很多。必須使用PCR擴增結合，ASO，SSCP或使用擴增片段長度多態性分析（AmpFLA）進行檢測，這些技術都較複雜，檢驗人員須經專業培訓。

血友病是一組最為常見的遺傳性凝血障礙，根據因子缺陷的不同分為甲、乙兩型，（Ⅷ、Ⅸ因子缺陷），也有複合型血友病，但不常見。甲型血友病發病率為1/10000，Ⅷ因子基因位於G6PD基因附近，全長186Kb，大範圍的基因重排（缺失、插入、重複）導致甲型血友病的病例很少，僅為Ⅷ因子缺陷的5%，大部分病人表現為單個或少數鹼基的突變。由於Ⅷ因子基因長度為186Kb，突變位點多，而且新生突變頻率高，從臨床角度講不能對每一個突變都檢測，可對最為常見的幾種突變類型進行檢測，主要的檢測手段是PCR結合RELP分析。乙型血友病發病率占血友病的20%，其基因變化及檢測方法與甲型血友病類似。

性別發育異常

區別雄性及雌性的物質基礎是性染色體，哺乳動物胚胎髮育中，雌性表型不需要任何調節，而雄性表型則由多因素決定，位於Y染色體上的指導雄性性別分ss化的基因命名為睾丸決定因子（TDF）。現代研究表明，SRY（Sex-determining region of Y chromosome）基因是TDF基因，位於Y染以體短臂末端。SRY區缺失易導致46XY核型個體發育成女性。進行基因檢測可以檢出SRY基因組的易位及缺失，從而診斷性別發育異常，這一探索性別異常的研究非常熱門。另外還有一種46XY核型異常的病人即睾丸女性化，這是用於雄激素受體（androgen receptor,AR）基因缺欠，使雄激素的靶基因對雄激素不應答就答或不全而引起的，根據病情的不同有不同的表型，AR缺陷有很高的新生突變頻率，表現為無家族史的散發病。AR基因長90Kb，位於X染色體上，AR基因異常大部分為個別基因鹼基的突變，可以通過PCR結合ASO或SSCP檢出。

脆—X綜合征

脆—X綜合片（fragile-X Syndrome,Frax）是發病率最高的一種X-連鎖的智力低下綜合症（X-linked mental retardation XLMR）。因這種綜合症與X染色體上的脆位點連鎖而得名。大多數FRAX男性智商（IQ）低於50，並有隨著年齡增長而下降的趨勢。用人工酵母染色體（artificial yeast chromosome,YAC）克隆技術分離獲得覆蓋X-脆位點區域的YAC克隆，在這一克隆中獲得一個能在人腦中表達的基因命名為FMR-1（fragile X mentai retardation-1）,FMR-1的5‘端有一個CGG（精）三核苷酸串（CGG）n,正常人群中（CGG）n中存在多態性，重複序列為6-46個，當重複超過52個時，此區域的分裂呈不穩定，導致重複序列大幅度增加，無臨床表現的攜帶者插入片段長度小於500bg，有臨床表現者，長度都大於600BP而且伴有甲基化。人們將500bp作為前突變與全突變的分界線。對Frax的診斷以前用細胞遺傳學的方法檢測脆位點，實驗條件嚴格，成功率不高。現在採用分子遺傳學方法即可診出前突變及全突變。用PCR擴增CGG重複序列，檢測擴增產物的長度。突變基因的擴增片段增大，體細胞異質性時出現多條長度不等的擴增帶甚至拖尾成一片，或者因為擴充的全突變插入片段過長超出PCR擴增能力而結果無擴增現象。

在“Torsch”診斷中的應用

PCR基因擴增法在“Torsch”診斷中的應用，在妊娠早期（1-3個月），有些病原微生物的感染易導致胎兒畸形，這些病原體中最常見的有弓體（TOX）、風疹病毒（RV）、單純皰疹病毒（HSV）、沙眼衣原體（CT）、及巨細胞（HCMV），對這幾種病原體的檢測根據其英文詞首簡稱為Torsch試驗。

弓形體的PCR檢測

弓形體有廣泛的自然疫原性，人體多為隱性感染，抵抗力低時可以有臨床表現。弓形體的診斷較困難，血清學方法敏感性較高但有交叉性出現假陽性而且無法確定近期感染、遠期感染或一過性感染。確診的方法是活組織檢查或動物接各，這些方法陽性率太低不能推廣。PCR檢測可以檢出樣本中1-2個病原體而且準確性高，是目前對弓形體檢測最優秀的方法。作為優生優育檢查應於妊娠前或妊娠早期取全血樣本，可以用EDTA或肝素抗凝，以EDTA抗凝效果最好，檢測外周血白細胞中是否有TOX存在。對於不孕，多次自然流產或養小動物的產期婦女，作弓形蟲檢測有更重要的臨床意義。

風疹病毒感染

風疹病毒（RV）是一種單股正極性RNA病毒，人是風診病毒的唯一宿主。RV感染可以引起胎兒的畸形，影響胎兒免疫系統的發育，因此RV檢測在優生優育工作中顯得非常重要。RV檢測可以用直接培養法及IgM抗體測試法。培養法費時很長而且常受到其它病毒的干擾，IgM測定法結果了不太準確，PCR法敏感性及特異性都很高而且簡便快速，是RV感染最優秀的測試方法之一。風疹病毒侵入體內后在上呼吸道增殖而出現癥狀，面部出現丘疹，迅速遍及全身。樣本採用妊娠母親的咽部拭子、血清、產婦的絨毛或妊娠如羊水等。RV病毒是RNA病毒，PCR擴增較複雜，應注意樣本的採集時機，操作的準確性。

單純皰診病毒

單純皰疹病毒（herpes simplex virus,HSV）是一種DNA病毒，可引起多器官的炎症，可通過性接觸傳播。HSVⅡ感染複發率高，80%的感染者於12個月內複發。HSV感染后經機體免疫系統清除，少數病人終生攜帶，體弱時複發。PCR法檢測HSV敏感性高而且可以直接對HSVⅠ/Ⅱ型進行分型鑒定。

沙眼衣原體

沙眼衣原體（CT）不僅能引起沙眼而且能引起生殖器感染，是一種性傳播性疾病。與淋病（NG），梅毒等經典性傳播性疾病不同，CT易經其它接觸途徑傳播，少數地區對妊娠期婦女普查結果表明此人群中發病率高達20%-30%。在歐美等國家CT的感染已超過淋病而居性傳播性疾病之首。衣原體感染常呈無症性或非特異性癥狀的隱性感染，不容易診斷。以往用培養法進行確診，費時且敏感性、準確性都不足。PCR用於CT檢測時應注意不同檢測目的的取材不同，對於性傳播性疾病診斷應取生殖道分泌物（查脫落細胞），而對於早期妊娠病人應查其全血樣本，在妊娠後期或臨產時再查陰道分泌物以便指導生育時產道清理。

人巨細胞（HCMV）

HCMV感染十分普遍，除少數原發性感染髮生原發性單核細胞增多症外，極大多數為隱性感染。HCMV可以長期潛伏在體內，當機體免疫功能低下時，病毒會激活而造成嚴重疾病在妊娠期如果孕婦感染HCMV可以引起早產、畸形、死胎及新生兒巨細胞包涵體病等。HCMV屬皰疹病毒科，可以從唾液、尿、宮頸分泌物及乳汁排出。HCMV“金標準”的診斷試驗是用單層成纖維細胞作病毒培養，其它的實驗檢查有血清學的檢測及包涵體檢測。PCR是HCMV檢測的一種新方法，用於檢測的樣本有血，生殖道分泌物拭子等，用於優生優育檢測時應取血樣本。對於早期妊娠病人若有HCMV感染應再檢測羊水，或其它妊娠物，對病人認真及進跟蹤檢查，綜合判斷並採取相應的醫療措施。

PCR應用於優生優育有很大的優越性，使這一技術的推廣應用剛剛起步，應注意操作的準確性，盡量避免誤診。對感染性疾病首先應取孕婦血樣檢測，有可疑時或血中檢出病原體核酸時應儘早作羊水等妊娠物檢查。不管是否懷疑胎兒有嚴重遺傳病傾和中或有感染引起的畸形風險，對胎兒的去留應尊重胎兒父母親的意見。

部分應用

新葯開發研究，人用藥物及其他藥物

針對一些感染性疾病的藥物，如各種病毒病、細菌病等，在新葯的開發過程中，快速了解藥物對疾病進程的影響可以為新葯開發節約大量的人力、時間和資金，與以前所用的Elisa等方法相比，實時熒光定量PCR技術可以快速、準確、定量、靈敏地測定血液或組織中病原體的含量，因此有利用分析藥物的作用效果，為比較不同的配方的療效、用藥量、用藥時間等等提供快速、定量的評價。

此方法除了用於人用藥物以外，還可以用於畜用藥物，甚至其他經濟動物及植物的藥物研究等，因此其在藥物研究方面的應用範圍是很廣的。

超早期感染用藥物及療法的研究與開發

實時熒光定量PCR方法測定是血液中病毒核酸的含量，因此不必等到病人體內產生抗體，同時，由於其靈敏度與Elisa相比不可同日而語，在病毒感染的早期，即血液中病毒含量很低時就可以測定。因此就出現了一個新的領域，即在病毒或細菌含量很低時如何用藥，用什麼葯以及用藥量等進行研究，為將疾病消滅在超早期作出貢獻。

藥物療效研究，人用藥物及其他藥物

對於一些已經上市的新葯或是應用了很長時間的老葯，其用藥的效果以及用藥量及用藥時間都可以進行進一步的研究，為更加合理化的應用這些藥物為人類造福進行進一步的研究。以前所用的方法由於不能準確定量，靈敏度也不夠，因此有很多需要研究的內容沒有完成。這一方面需要研究內容很多，意義也很大。

新的愈后指標的研究

對於感染性疾病，在藥物作用至一定程度后，就認為可以停葯了，但是應該在什麼停葯，現在大都沒有一個明確的指標，現在所用的指標由於受到檢測方法的靈敏度及準確性限制，這一指標未必合理，因此有必要對治癒的指標以及指標與複發率以及疾病轉化為其他疾病之間的關係等進行進一步的研究，從而為藥物或療法徹底治癒疾病打下堅實的理論基礎。

新診斷及檢驗試劑的開發

現有的很多診斷及檢驗方法都不能同時滿足快速、靈敏、定量的要求如現有培養法、Elisa法等等，而熒光定量PCR方法以則可以做到這一點，從而可為臨床疾病、商檢、糧油檢驗、食品檢驗、血液檢驗等等開發新的試劑，從而提高檢驗的靈敏度、速度及準確性等；這類試劑的種類是非常多的，所開發的試劑的社會效益及經濟效益都是很巨大的。

血液檢驗漏檢率

由於實時熒光定量PCR方法比Elisa靈敏很多，因此，血站或血液研究所一般用來研究Elisa方法的漏檢率，即分析Elisa方法測定為陰性的血樣，再用實時熒光定量PCR方法來複檢。複檢時，一般24個Elisa陰性的血樣混合成一個樣本進行檢測。上海用此方法在用於血液製品的血液中發現一例HIV，后經測定供血者，證實病人的確是HIV陽性。北京市紅十字血液中心正在測定北京血站中5萬份Elisa陰性血樣的漏檢率。由於不同地區所用的Elisa試劑、方法、批號等都不相同，因此不同地區都有必要進行這一工作。

由於熒光定量PCR方法的快速、靈敏、定量的特點，其在研究及開發方面的應用是不勝枚舉的，如研究個人基因型與藥物療效之間的關係等；研究人員也可以根據自己研究項目開發其新的用途。