T載體克隆

重組質粒的構建

重組的DNA分子是在DNA連接酶的作用下，有Mg2 、ATP存在的連接緩衝系統中，將分別經酶切的載體分子與外源DNA分子進行連接。

DNA連接酶有兩種：T4噬菌體DNA連接酶和大腸桿菌DNA連接酶。兩種DNA連接酶都有將兩個帶有相同粘性末端的DNA分子連在一起的功能，而且T4噬菌體DNA連接酶還有一種大腸桿菌DNA連接酶沒有的特性，即能使兩個平末端的雙鏈DNA分子連接起來。但這種連接的效率比粘性末端的連接率低，一般可通過提高T4噬菌體DNA連接酶濃度或增加DNA濃度來提高平末端的連接效率。 T4噬菌體DNA 連接酶催化DNA 連接反應分為3 步：首先，T4 DNA 連接酶與輔因子ATP形成酶-ATP複合物；然後，酶-ATP複合物再結合到具有5’磷酸基和3’羥基切口的DNA上，使DNA腺苷化；最後產生一個新的磷酸二酯鍵，把切口封起來。連接反應通常將兩個不同大小的片斷相連。

很多DNA聚合酶在進行PCR擴增時會在PCR產物雙鏈DNA每條鏈的3’端加上一個突出的鹼基A。pUCm-T載體是一種已經線性化的載體，載體每條鏈的3’端帶有一個突出的T。這樣，pUCm-T載體的兩端就可以和PCR產物的兩端進行正確的AT配對，在連接酶的催化下，就可以把PCR產物連接到pUCm-T載體中，形成含有目的片斷的重組載體。

連接反應的溫度在37℃時有利於連接酶的活性。但是在這個溫度下粘末端的氫鍵結合是不穩定的。因此採取折中的溫度，即12-16℃，連接12-16h（過夜），這樣既可最大限度地發揮連接酶的活性，又兼顧到短暫配對結構的穩定。

細菌在0°C CaCl2低滲溶液中脹成球形，丟失部分膜蛋白，成為容易吸收外源DNA的感受態。

LacZ基因是大腸桿菌乳糖操縱子中的一個基因，可以編碼β—半乳糖核苷酶。β—半乳糖核苷酶是由4個亞基組成的四聚體，可催化乳糖的水解．用X-Gal為底物進行染色時，呈藍色。

一些特定的質粒（比如pUC/pBS等），常帶有β—半乳糖核苷酶的調控序列和β—半乳糖核苷酶N端146個氨基酸（α肽段）的編碼序列，在這個編碼序列里還插入一個多克隆位點（MCS）,它並不影響lacZ的表達。另外，常用的大腸桿菌帶有β—半乳糖核苷酶C端部分序列（β肽段），的編碼序列。在各自獨立的情況下，這些質粒與大腸桿菌各自編碼的β—半乳糖核苷酶片段都沒有酶的活性。只有當攜帶α肽編碼信息的克隆載體成功進入宿主細胞，在培養基誘導物IPTG的誘導下，載體質粒能夠合成β—半乳糖核苷酶N端（α肽段），這樣就與宿主細胞合成的β—半乳糖核苷酶C端部分序列（β肽段）互補，形成完整的β—半乳糖核苷酶活性蛋白。

而當外源基因插入到此種載體質粒lacZ的多克隆位點后，會造成lacZ基因不能表達，從而不能合成β—半乳糖核苷酶；而對於空載體，lacZ基因正常表達，通過α互補合成β—半乳糖核苷酶，分解培養基里的色素底物X-gal，最終形成藍色的化合物，出現藍色菌斑。

清洗，5個100ml錐形瓶，1個50ml錐形瓶，6副培養皿，3個小試劑瓶，接種環，塗布棒

準備100ml超純水

溶液:LB300ml(液體50ml+50ml，固體100ml)，0.1mol/L CaCl2 10ml， 100mg/mlAmp 1 ml，

20mg/mlX-gal 1 ml， 200mg/ml IPTG 1 ml。

大腸桿菌菌液1ml

滅菌：5個100ml錐形瓶（外加1個小的），6副培養皿，3個小試劑瓶，接種環，塗布棒，10ml超純水，LB培養基，1.5mlEP管，大小槍頭，過濾用具2副，，0.1mol/L CaCl2

20mg/ml X-gal X-gal為5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D半乳糖苷。用 二基甲醯胺（DMF）溶解X-gal配製成的20mg/ml（取0.02gX-gal，用DMF定容為1ml）的貯存液。保存於一玻璃管或聚丙烯管中，裝有X-gal溶液的試管須用鋁箔封裹以防因受光照而被破壞，並應貯存於-20℃。X-gal溶液無須過濾除菌。（DMF二甲基甲醯胺; Dimethylformamide; N,N-Dimethylformamide; DMF; CAS：68-12-2　理化性質：無色、淡的胺味的液體。分子式C3-H7-N-O。分子量73.10。相對密度0.9445(25℃)。熔點-61℃。沸點152.8℃。）溶於DMSO，溶解度可達20mg/ml。也溶於DMF

200mg/ml IPTG 在0.8ml蒸餾水中溶解0.2g IPTG后，用蒸餾水定容至1ml，用0.22μm濾器過濾除菌，貯存於-20℃。

LB培養基：

配製每升培養基，應該在950 ml去離子水中加入：胰化蛋白腖 10g 酵母提取物 5g NaCl 10g 搖動容器直至溶質溶解。用5mol/LNaOH調pH至7.3.用去離子水定容至1L.在15psi高壓下蒸汽滅菌20min.（ 100mlLB培養基加入1.5g瓊脂粉為固體培養基）

0.1mol/LCaCl2：取0.11098g氯化鈣固體定容至10ml

Amp（100mg/ml）：溶解0.1g氨苄青霉素鈉鹽於足量的水中，最後定容至1ml，用0.22μm濾膜過濾除菌.

器材

旋渦混合器，微量移液取樣器，移液器吸頭，1.5ml 微量離心管，雙面離心管架，台式離心機，乾式恆溫氣浴。

試劑

T 載體，T4 DNA 連接酶，連接酶緩衝液，無菌dd Water

操作步驟

PCR產物與T載體直接連接：

（1）事先將乾式恆溫儀（或冰盒裡的水）溫度設定在14~16°C。

（2）取4個滅菌的200ul微量離心管，加入：（需要調整）

4ul 目的基因

1ul T載體

0.5ul T4 DNA連接酶（TAKARA, 350U/ul）

1ul 連接酶緩衝液10 x buffer

3.5 ul dd Water

總量10ul 體系

（3）上述混合液輕輕震蕩后再短暫離心，然後置於14°C乾式恆溫儀（或14°C水中）中保溫過夜（12-16h）。

（4）連接后的產物可以立即用來轉化感受態細胞或置4°C冰箱備用。

大腸桿菌感受態細胞的製備細菌轉化

器材

旋渦混合器，微量移液取樣器，移液器吸頭，50ml 微量離心管，1.5ml 微量離心管，台式冷凍離心機，製冰機，恆溫搖床，分光光度計，超凈工作台，恆溫培養箱，搖菌試管，三角燒瓶，接種環，恆溫搖床，培養皿（已鋪好固體LB-Amp），酒精燈，玻璃塗棒，恆溫培養箱，濾膜和過濾器

試劑

E. coli菌種，LB培養基，0.1 mol/L CaCl2溶液，無菌dd Water ，LB培養基（不加抗菌素），LB培養基（加抗菌素），無菌dd water，IPTG，X-gal。

步驟

（1）在超凈工作台中，將1ml大腸桿菌菌液加入100ml LB液態培養基（不含抗菌素），37℃搖床培養過夜。

（2）取0.5ml上述菌液轉接到含有50mL LB培養基的三角燒瓶中，37℃下250r/min搖床培養2~3h，測定OD590為0.35~0.4左右（<0.4~0.6，細胞數<108/mL，此為關鍵參數！）。（注意：此步搖菌的時候，要有一管不加菌的LB培養液同時搖菌）

（3）將1ml菌液加入到4支1.5mL預冷無菌的聚丙烯離心管中，於冰上放置10min，然後於4℃，5000rpm離心5min。

（4）將離心管倒置以倒盡上清液，加入1ml 冰冷的0.1 mol/L CaCl2溶液，立即在渦旋混合器上混勻，插入冰中放置30min。

（5） 4℃，5000rpm離心5min，棄上清液后，用100μL 冰冷的0.1 mol/L CaCl2溶液垂懸，插入冰中放置2h，可以直接用作轉化實驗，或立即放入-4攝氏度冰櫃中保藏。

（6）事先將恆溫水浴的溫度調到42℃。

（7）從-70℃ 超低溫冰櫃中取出一管（100μL）感受態菌，立即用手指加溫融化后插入冰上，冰浴5~10min。

（8）加入5μL連接好的質粒混合液（DNA含量不超過100ng），輕輕震蕩後放置冰上20min。

（9）輕輕搖勻后插入42℃水浴中90s進行熱休克，然後迅速放回冰中，靜置3min。

（10）在超凈工作台中向上述各管中分別加入300μL LB培養基（不含抗菌素）輕輕混勻，然後固定到搖床的彈簧架上37℃震蕩1h。

（11）在超凈工作台中取上述轉化混合液200μL，分別滴到含合適抗菌素（Amp 100mg/L）的固體LB平板培養皿中，再在平板上滴加40μL 20mg/ml X-gal，7μL 200mg/ml IPTG，用酒精燈燒過的玻璃塗布棒塗布均勻（注意：一個不含抗生素作為對照組，玻璃塗布棒上的酒精熄滅后稍等片刻，待其冷卻后再塗，菌液塗皿操作時，應避免反覆來回塗布，因為感受態細菌的細胞壁有了變化，過多的機械擠壓塗布會使細胞破裂，影響轉化率。）。

（12）在塗好的培養皿上做上標記，先放置在37℃恆溫培養箱中30min直到表面的液體都滲透到培養基里后，再倒置過來放入37℃恆溫培養箱過夜。

（13）在被細菌污染的桌面上噴灑70%乙醇，擦乾桌面。

（14）觀察平板上長出的菌落克隆，以菌落之間能互相分開為好。注意白色菌斑。

器材

旋渦混合器，小鑷子，微量移液取樣器，移液器吸頭，1.5ml 微量離心管，雙面離心管架，乾式恆溫氣浴（或恆溫水浴鍋），製冰機，恆溫搖床，超凈工作台，酒精燈，無菌牙籤，搖菌管。

試劑

LB培養基（加抗菌素），PCR用試劑，引物，質粒提取用試劑，酶切需要的限制性內且酶及其緩衝液，65%甘油（65%甘油，0.1mol/L MgSO4，0.025mol/L Tris Cl pH8.0）。

操作步驟

方法一：快速PCR篩選法

（1）在轉化的平板培養基上隨機選取4個邊緣清晰的白色菌落，並用記號筆在其所在的培養皿底部玻璃背面畫圈做標記編號。

（2）在0.2ml PCR 微量離心管中配製25μl反應體系。

dd water 16μl

10×PCR buffer（不含MgCl2）2.5μl

25mM MgCl2 1.5μl

2.5mmol/L dNTP 2μl（每種dNTP終濃度0.2mM）

10μmol/L Primer1 1μl（12.5—25pmoles）

10μmol/L primer2 1μl （12.5—25pmoles）

模板質粒用小tip頭輕輕粘一下選中的白色菌落，再伸入PCR混合液中洗一洗

Taq酶 0.5μl （1.5u）

總體積 25μl

（2）根據廠商的操作手冊設置PCR儀的循環程序（本實驗室已經設置為WZ）：

① 94℃5min

②94℃1min

③60℃1min

④72℃1min50s

⑤goto②29 times

⑥72℃10min

（2） PCR 結束后，取10μl產物進行瓊脂糖凝膠電泳（與原始插入片斷同時比對）。觀察膠上是否有預計的主要產物帶。

（3）按照編號找到培養皿中的原菌斑。根據需要進行放大培養提取其質粒

（4）提取到的質粒與原先的空載體（或已知分子量的質粒）再對比電泳，以進一步確認。

方法二：提質粒再PCR或酶切鑒定

（1）在超凈工作台中取3支無菌搖菌管，各加入3mL LB（含50mg/mL氨苄青霉素），用記號筆寫好編號。

（2）在超凈工作台中將70%乙醇浸泡的小鑷子頭用酒精燈烤過，鑷取一支無菌牙籤。用牙籤的尖部接觸轉化的平板培養基上的一個白色菌落，然後將牙籤放入盛有3mL LB（含50mg/mL氨苄青霉素）的搖菌管中。用此法隨機取3個白色菌落，分別裝入3個搖菌管中。

（3）37℃搖菌過夜后，用鹼裂解法分別提取質粒。搖菌管中的剩餘菌液保留在4℃冰箱中。

（4）提取到的3管質粒樣品可用PCR法擴增，或用酶切電泳法來鑒定其上是否含有外源插入片斷（方法見有關實驗）。

（5）將經過鑒定判斷為正確的質粒保存。按照編號找到冰箱中原菌液。根據需要進行放大培養提取其質粒或進行誘導表達，或取500mL菌液與500mL 65%甘油混合后-80℃保存。

（6）在被細菌污染的桌面上噴灑70%乙醇，擦乾桌面