生物晶元技術

生物晶元（biochip）是指採用光導原位合成或微量點樣等方法，將大量生物大分子比如 核酸片段、多肽分子甚至組織切片、細胞等等生物樣品有序地固化於支持物的表面，組成密集二維分子排列，然後與已標記的待測生物樣品中靶分子雜交，通過特定的儀器對雜交信號的強度進行快速、并行、高效地檢測分析，從而判斷樣品中靶分子的數量。由於常用矽片作為固相支持物，且在製備過程模擬計算機晶元的製備技術，所以稱之為生物晶元技術。

目前，最成功的生物晶元形式是以基因序列為分析對象的“微陣列（microarray）”，也被稱為基因晶元（Gene chip）或DNA晶元（DNA chip）。1998年6月美國宣布正式啟動基因晶元計劃，聯合私人投資機構投入了20億美元以上的研究經費。世界各國也開始加大投入，以基因晶元為核心的相關產業正在全球崛起，目前美國已有8家生物晶元公司股票上市，平均每年股票上漲75%，據統計全球目前生物晶元工業產值為10億美元左右，預計今後5年之內，生物晶元的市場銷售可達到200億美元以上。生物晶元技術通過微加工工藝在厘米見方的晶元上集成有成千上萬個與生命相關的信息分子，它可以對生命科學與醫學中的各種生物化學反應過程進行集成，從而實現對基因、配體、抗原等生物活性物質進行高效快捷的測試和分析。它的出現將給生命科學、醫學、化學、新葯開發、生物武器戰爭、司法鑒定、食品與環境監督等眾多領域帶來巨大的革新甚至革命。

自從1996年美國Affymetrix公司成功的製作出世界上首批用於藥物篩選和實驗室試驗用的生物晶元，並製作出晶元系統，此後世界各國在晶元研究方面突飛猛進，不斷有新的突破。美國的Hyseq公司、Syntexi公司、Nanogen公司、Incyte公司及日本、歐洲各國都積極開展DNA晶元研究工作；摩托羅拉、惠普、IBM等跨國公司也相繼投以巨資開展晶元研究。1998年12月Affymefrix公司和Molecular Dynamics公司宣布成立基因分析協會（genetic analysis technology consortium）以制定一個統一的技術平台生產更有效而價廉的設備，與此相呼應，英國的Amershcem?Pharmacia?Biotechnology公司也在同一天宣布將提供部分掌握的技術以推動這項技術的應用。美國晶元技術召開了兩次會議，柯林頓總統在會上高度讚賞和肯定該技術，將晶元基因技術看作是保證一定橫健康的指南針。預計在今後5年內生物晶元銷售可達200～300億美元；據預測，在21世紀，生物晶元對人類的影響將可能超過微電子晶元。

我國在生物晶元研究方面剛剛起步，1998年10月，中科院將基因晶元列為“九五”特別支持項目，利用中科院在微電子技術、生化技術、物理檢測技術方面的優勢，組織跨所、跨學科合作。在微陣列晶元和基於MEBS的晶元方面有大突破，在DNA晶元設計、基本修飾、探針固定、樣品標記、雜交和檢測等方面的技術有較大進展，已研製出肝癌基因差異表達晶元、乙肝病毒多態性檢測晶元、多種惡性腫瘤病毒基因晶元等有一定實用意義的基因晶元和DNA晶元檢測儀樣機。中科院上海冶金所等開發重大傳染性疾病的診斷晶元及檢測設備，如HBV、HCV、TB三種基因診斷晶元。上海細胞所正在進行人類全套基因組的c?DNA陣列和微陣列製備，為我國科研所和開發提供了一個技術平台，並使之產業化。同時，清華、復旦、東南大學、北京軍事醫學科學院、華東理工大學、第一軍醫大學等單位都在積極進行晶元研究，現已有部分產品問世。

原定於2005年竣工的人類30億鹼基序列的測定工作（Human Genome Project，基因組計劃）由於高效測序儀的引入和商業機構的介入已經完成。怎樣利用該計劃所揭示的大量遺傳信息去探明人類眾多疾病的起因和發病機理，並為其診斷、治療及易感性研究提供有力的工具，則是繼人類基因組計劃完成後生命科學領域內又一重大課題。現在，以功能研究為核心的后基因組計劃已經悄然走來，為此，研究人員必需設計和利用更為高效的硬軟體技術來對如此龐大的基因組及蛋白質組信息進行加工和研究。建立新型、高效、快速的檢測和分析技術就勢在必行了。這些高效的分析與測定技術已有多種，如DNA質譜分析法，熒光單分子分析法，雜交分析等。其中以生物晶元技術為基礎的許多新型分析技術發展最快也最具發展潛力。早在1988年，Bains等人就將短的DNA片段固定到支持物上，以反向雜交的方式進行序列測定。當今，隨著生命科學與眾多相關學科（如計算機科學、材料科學、微加工技術、有機合成技術等）的迅猛發展，為生物晶元的實現提供了實踐上的可能性。生物晶元的設想最早起始於80年代中期，90年代美國Affymetrix公司實現了DNA探針分子的高密度集成，即將特定序列的寡核苷酸片段以很高的密度有序地固定在一塊玻璃、硅等固體片基上，作為核酸信息的載體，通過與樣品的雜交反應獲取其核酸序列信息。生物晶元由於採用了微電子學的并行處理和高密度集成的概念，因此具有高效、高信息量等突出優點。

基因晶元用途廣泛，在生命科學研究及實踐、醫學科研及臨床、藥物設計、環境保護、農業、軍事等各個領域有著廣泛的用武之地。這些無疑將會產生巨大的社會和經濟效益。有著廣泛的經濟、社會及科研前景。因此，國際上一些著名的政治家，投資者和科學家均看好這一技術前景。認為基因晶元以及相關產品產值有可能超過微電子晶元，成為下一世紀最大的高技術產業，具有巨大的商業潛力。

1、高密度晶元的批量製備技術：利用平面微細加工技術，結合高產率原位DNA合成技術，製備高密度晶元是重要的發展趨勢。

2、高密度基因晶元的設計將會成為基因晶元發展的一個重要課題，它決定基因晶元的應用和功能。利用生物信息學方法，根據被檢測基因序列的特徵和檢測要求，設計出可靠性高，容錯性好，檢測直觀的高密度晶元是決定其應用的關鍵。

3、生物功能物質微陣列晶元的研製：發展高集成度的生物功能單元的微陣列晶元，特別是發展蛋白質、多肽、細胞和細胞器、病毒等生物功能單元的高密度自組裝技術，研製和開發有批量製備潛力的生物晶元製備技術。

基因晶元可為研究不同層次多基因協同作用提供手段。這將在研究人類重大疾病的相關基因及作用機理等方面發揮巨大的作用。人類許多常見病如腫瘤、心血管病、神經系統退化性疾病、自身免疫性疾病及代謝性疾病等均與基因有密切的關係。

生物晶元能為現代醫學發展提供強有力的手段，促進醫學從“系統、血管、組織和細胞層次”（第二階段醫學）向“DNA、RNA、蛋白質及其相互作用層次”（第三階段醫學）過渡，使之儘快進入實際應用。

DNA晶元技術可用於水稻抗病基因的分離與鑒定。水稻是中國的主要糧食作物，病害是提高水稻產量的主要限制因素。利用轉基因技術進行品種改良，是目前最經濟有效的防治措施。而應用這一技術的前提是必須首先獲得優良基因克隆，但目前具有專一抗性的抗病基因數量有限，限制了這一技術的應用。而基因晶元用於水稻抗病相關基因的分離及分析，可方便的獲取抗病基因，產生明顯的社會效益。

在醫藥設計、環境保護、農業等各個領域，基因晶元均有很多用武之地，成為人類造福自身的工具。

美國總統柯林頓在1998年1月對全國的演講中指出“未來十二年，基因晶元將為我們一生中的疾病預防指點迷津”。1998年6月27日華盛頓郵報在報道Motorola進入基因晶元領域時，認為這將造福於子孫後代。美國“Fortune”雜誌在1997年3月重點介紹了基因晶元技術，論述了未來產業化的前景，該文預測“在2005年僅僅在美國用於基因組研究的晶元銷售額將達約50億美元，2010年有可能上升為400億美元”。這還不包括用於疾病預防及診治以及其它領域中的基因晶元，這部分預計比基因組研究用量還要大上百倍。

由於生物晶元的重大意義和巨大的商業潛力，北美和歐洲許多國家的政府和公司投入大量人力物力來推動此項研究工作。如美國的國立衛生研究院、商業部高技術署、國防部、司法部和一些大公司以及風險投資者投入了數億美元的巨資。基因晶元以及相關產品產業有可能成為下一世紀最大的高技術產業之一。

對來源於不同個體（正常人與患者）、不同組織、不同細胞周期、不同發育階段、不同分化階段、不同病變、不同刺激（包括不同誘導、不同治療階段）下的細胞內的mRNA或逆轉錄后產生的cDNA與表達譜基因晶元進行雜交，可以對這些基因表達的個體特異性、組織特異性、發育階段特異性、分化階段特異性、病變特異性、刺激特異性進行綜合的分析和判斷，迅速將某個或幾個基因與疾病聯繫起來，極大地加快這些基因功能的確立，同時進一步研究基因與基因間相互作用的關係。所以，無論何種研究領域，利用表達譜基因晶元可以獲得大量與研究領域相關的基因，使研究更具目的性和系統性，同時也拓寬研究領域。

根據晶元上的固定的探針不同，生物晶元包括基因晶元、蛋白質晶元、細胞晶元、組織晶元，另外根據原理還有元件型微陣列芯。表達譜基因晶元是用於基因功能研究的一種基因晶元。是目前技術比較成熟，應用最廣泛的一種基因晶元。

採用表達譜基因晶元研究基因表達與傳統的Northern Blot相比有許多重要的優點：

檢測系統的微型化，對樣品等需要量非常小

同時研究上萬個基因的表達變化，研究效率明顯提高

能更多地揭示基因之間表達變化的相互關係，從而研究基因與基因之間內在的作用關係

檢測基因表達變化的靈敏度高，可檢測丰度相差幾個數量級的表達情況

節約費用和時間

製作技術

光引導原位合成

原位合成適於製造寡核苷酸和寡肽微點陣晶元，具有合成速度快、相對成本低、便於規模化生產等優點。照相平板印刷技術是平板印刷技術與DNA和多肽固相化學合成技術相結合的產物，可以在預設位點按照預定的序列方便快捷地合成大量寡核苷酸或多肽分子。在生物晶元研製方面享有盛譽的美國Affymetrix公司運用該技術製造大規模集成Genechip。原位合成后的寡核苷酸或多肽分子與玻片共價連接。它用預先製作的蔽光板和經過修飾的4種鹼基，通過光進行活化從而以固相方式合成微點陣。合成前，預先將玻片氨基化，並用光不穩定保護劑將活化的氨基保護起來。聚合用單體分子一端活化另一端受光敏保護劑的保護。選擇適當的擋光板使需要聚合的部位透光，不需要發生聚合的位點蔽光。這樣，光通過擋光板照射到支持物上，受光部分的氨基解保護，從而與單體分子發生偶聯反應。每次反應在成千上萬個位點上添加一個特定的鹼基。由於發生反應后的部位依然接受保護劑的保護，所以可以通過控制擋光板透光與蔽光圖案以及每次參與反應單體分子的種類，就可以實現在特定位點合成大量預定序列寡核苷酸或寡肽的目的。由於照相平板印刷技術每步的合成效率較低（95%），合成30nt的終產率僅為20%，所以該技術只能合成30nt左右長度的寡核苷酸。在此基礎上，有人將光引導合成技術與半導體工業所用的光敏抗蝕技術相結合，以酸作為去保護劑，將每步合成產率提高到99%，但製造工藝複雜程度增加了許多。所以如何簡便地提高合成產率是光引導原位合成技 術有待解決的問題。（見下圖）

列印原位合成

壓電列印原位合成的方式類似於噴墨印表機，合成原理與傳統的核酸或寡肽固相合成技術相同。合成過程為：合成前以與光引導原位合成類似的方式對晶元片基進行預處理，使其帶有反應活性基團，例如伯氨基。同時，將合成用前體分子（DNA合成鹼基、cDNA和其它分子）放入列印墨盒內，由電腦依據預定的程序在xyz方向自動控制列印噴頭在晶元支持物上移動，並根據晶元不同位點探針序列需要將特定的鹼基合成前體試劑（不足納升）噴印到特定位點。噴印上去的試劑即以固相合成原理與該處支持物發生偶聯反應。由於脫保護方式為酸去保護，所以每步延伸的合成產率可以高達99%，合成的探針長度可以達到40~50nt。以後每輪偶聯反應依據同樣的方式將需要連接的分子噴印到預定位點進行後續的偶聯反應。類似地重複此操作可以在特定位點按照每個位點預定的序列合成出大量的寡核苷酸探針。

點樣法在多聚物的設計方面與原位合成技術相似。只是合成工作用傳統的DNA、多肽合成儀或PCR擴增或體內克隆等方法完成。大量製備好的核酸探針、多肽、蛋白等生物大分子再用特殊的自動化微量點樣裝置將其以較高密度互不干擾地印點於經過特殊處理的玻片、尼龍膜、硝酸纖維素膜上，並使其與支持物牢固結合。支持物需預先經過特殊處理，例如多聚賴氨酸或氨基硅烷等。亦可用其它共價結合的方法將這些生物大分子牢牢地附著於支持物上。現在已經有比較成型的點樣裝置出售，例如美國Biodot公司的“噴印”儀以及Cartesian Technologies公司的Pix-Sys NQ/PA系列“列印”儀。這些自動化儀器依據所配備的“列印”或“噴印”針將生物大分子從多孔板吸出直接“列印”或“噴印”於晶元片基上（見下圖）。“列印”時針頭與晶元片基表面發生接觸而“噴印”時針頭與片基表面保持一定的距離。所以，“列印”儀適宜製作較高密度的微陣列（例如2500點/cm2），“噴印”法由於“噴印”的斑點較大，所以只能形成較低密度的探針陣列，通常400點/cm2。點樣法製作晶元的工藝比較簡單便於掌握、分析設備易於獲取，適宜用戶按照自己的需要靈活機動地設計微點陣，用於科研和實踐工作。

目前，除了在生物晶元研製方面享有盛譽的Affymetrix公司等個別公司使用原位合成技術製造晶元外，大多中小型公司普遍採用點樣技術製作生物晶元。

熒游標記和檢測是利用熒光標記的DNA鹼基在不同的波長下吸收和發射光。在微陣列分析中，多色熒游標記可以在一個分析中同時對二個或多個生物樣品進行多重分析，多重分析能大大地增加基因表達和突變檢測結果的準確性，排除晶元與晶元間的人為因素。熒光為基礎的分析使得利用一些先進的數據獲得技術成為可能，包括共聚焦掃描的CCD照相技術。用於晶元製備的無孔基質表面使得晶元檢測中的生化反應大大受益。玻璃基質所需的反應體積（5-200ul）比傳統的分析要小的多（5-50ml），小反應體積降低了試劑的消耗，增加了微陣列分析中核酸的反應物的濃度（0.1-1um），相對於傳統分析（0.1-4pm）增加100000倍之多，濃度的增加又能加速雜交的速度，從而減少獲得強熒光信號的時間，並可用蓋玻片封閉雜交槽進行雜交反應。對於以核酸雜交為原理的檢測技術，主要過程為：首先用生物素標記經擴增（也可使用其它放大技術）的靶序列或樣品然後再與晶元上的大量探針進行雜交。用鏈霉親和素（streptavidin）偶聯的熒光素（常用的熒光素還有lassamine 和phycoerythrin）作為顯色物質，圖象的分析則用落謝熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡或其它熒光顯微裝置對片基掃描，由計算機收集熒光信號，並對每個點的熒光強度數字化後進行分析。由於完全正常的 Watson-Crick配對雙鏈要比具有錯配（mismatch）鹼基的雙鏈分子具有較高的熱力學穩定性，所以，前者的熒光強度要比後者強出5-35%。從這一點來說，該檢測方法是具有一定特異性的，而且熒光信號的強度還與樣品中靶分子含量呈一定的線性關係。

目前用熒光探針作為檢測信號的儀器，主要是考慮熒游標記所要檢測的DNA的效率，以及熒光探針本身的發光效率和光譜特性。

PCR過程中的DNA標記

1.末端標記：在引物上標記有熒光探針，在DNA擴增過程時，使新形成的DNA鏈末端帶有熒光探針。

2 .隨機插入：選擇四種緘機基，使其中一種或幾種掛有熒光探針，在PCR過程中，帶有熒光探針的鹼基和不帶熒光探針的鹼基，同時參與DNA鏈的形成。由於帶有熒光探針的鹼基，可能影響PCR的產物，因此，需要調整熒游標記的鹼基與未標記的鹼基比率，以使得PCR產量和帶有熒光探針的鹼基在DNA的插入率達到一個平衡的水平，使雜交信號最強。

RNA轉錄過程的熒光探針標記

某一種鹼基標記有熒光，但要求該種鹼基標記與非標記按一定比率混合，以達到最佳轉錄效果。

探針的選擇

主要考慮以下幾個因素：

熒光探針的激發和發射頻譜；

熒光探針的發光效率；

熒光探針對PCR或逆轉錄效率的影響；

不同熒光探針的發射光譜是否有重疊。

常用的熒光探針：FITC，CY-3，ALEAX488，CY-5，ALEAX564

一旦熒游標記樣品和微陣列反應后，未結合的成分就可洗去，結合到晶元的樣品可通過熒光檢測裝置進行檢測。聚焦掃描儀和CCD相機均已成功地應用於晶元的檢測。聚焦掃描主要是利用玻璃基質小區域（約100um2）的激光發曬透鏡（或兩者）使整個影像聚集，每個位點上帶熒光的樣品發射的光通過一系列的反光鏡，光片和晶體后與不要的光分開，然後被光電倍增管（或一種類似的裝置）轉換成一種電信號。聚焦掃描聚焦數據的速度（1-5min）要比傳統實驗中的放射自顯影快的多（1-10天），快速的熒光檢測技術是晶元檢測技術的一次革命。CCD相機利用許多與聚焦掃描儀相同的原理聚焦熒光影像。

該過程指將從生物樣品分離到的蛋白、DNA或RNA樣品與生物晶元進行反應，從固定於晶元的探針陣列得到樣品的序列信息。由於玻片本身的熒光本底很低，所以可用熒游標記的方法來對生物晶元實施檢測和分析，同時具有快速、精確和安全等優點。而且，還可用多個熒光素進行標記以實現一次性分析多個生物樣品。玻片作為支持物還可使反應體積縮小到5-200μl，而通常的雜交反應體積為5-50ml。這樣一方面節約了試劑，同時還可以提高反應試劑的有效濃度（0.1-1μM），是常規檢測（0.4-4pM）的一萬倍。因此促進了雜交速度減少了雜交時間，並可取得較強的熒光信號。

RNA樣品通常需要首先逆轉錄成cDNA並進行標記后才可進行檢測。目前，由於檢測靈敏度所限，尚難以普通探針對極少量的核酸分子進行雜交和檢測，所以需要對樣品或後續測試信號進行適當的放大。多數方法需要在標記和分析前對樣品進行適當程度的擴增，例如通過PCR方法，以使樣品核酸的拷貝數有所提高達到檢測的靈敏度。但用DNA晶元進行檢測分析時需要對樣品大量的DNA片段進行擴增和標記，所以需要同時對樣品核酸分子大量的區域進行擴增，這是一項工作量非常巨大的工作。順應這一要求出現了許多解決辦法，並在不同程度上減輕了工作量。例如，Mosaic Technologies公司引入的固相PCR方法，將多對引物固定於支持物上（其位置和序列信息預定），以類似於原位PCR的方式一次性對樣品多個片段進行擴增和放大，而且不會由於引物種類過多而出現相互間的競爭和抑制（這種情況曾出現於多重PCR中）。引物具有較強的特異性，擴增反應也不存在交叉污染，因而省略了處理常規多重和多個PCR反應的繁瑣工作。再如，Lynx Therapeutics公司引入的大規模并行克隆（massively parallel solid-phase cloning），可在一個樣品中同時對數以萬計的DNA片段進行克隆，且無需單獨處理和分離每個克隆。

除了檢測前對樣品分子的放大外，通常仍需要有高靈敏度的檢測設備來採集、處理和解析生物信息。但，亦有不經過對樣品的擴增和放大而直接應用特殊處理的探針，例如分支探針技術，而達到較高的檢測靈敏度水平。這種方法的原理是，設計具有龐大分支結構的分支核苷酸探針，分支末端以酶標記。這樣，經過分支核苷酸與酶的雙重放大作用而將標本雜交時極弱的信號轉換為較強的化學信號。該技術比較成功的例子就是HCV與HBV的檢測。它的最大優點在於其操作簡便，具有較高的靈敏度，同時也可以保證檢測結果的特異性。當然，由於不同檢測方式的靈敏度不同對於樣品的處理和擴增情況的要求亦有所不同，具體的處理和放大方法仍需根據實際情況進行選擇。

同樣，基於生物大分子相互作用原理的生物晶元在檢測時生物樣品的處理遵循相似的方式，即信號的放大和樣品的標記。例如，蛋白晶元在進行檢測和分析時，可以將待分析的蛋白樣品用熒光素或其它物質進行標記，然後與生物晶元上的生物大分子進行相互作用，最後依據標記物質的不同採取相應的檢測方式採集和分析樣品和晶元上生物大分子相互作用的結果。對與非核酸類的生物大分子，存在的問題是有時不便於對其進行擴增和放大，因為其它生物大分子的結構相對比較複雜不能進行簡便的克隆或擴增。所以，這就向檢測的靈敏度提出了更高的要求。其它生物大分子的檢測和分析類似與蛋白分子。例如核酸與蛋白的相互作用，配體間的相互作用，糖與蛋白的相互作用等。