魷魚墨黑色素

魷魚是頭足類海洋動物中槍烏賊和柔魚的俗稱。據報道，全世界大洋中頭足類的總資源量為4.2-6.5億噸。隨著世界遠洋海洋生物資源的日益減少，魷魚因其味道鮮美、營養豐富而逐漸成為人類重要的蛋白質資源。魷魚加工的品種主要有北太平魷魚（Ommastrephes bartrami）、阿根廷魷魚（Illes argentinus）、紐西蘭魷魚（Nototodaras sloani）等，魷魚的可食部分接近80%，比一般魚類高出20%左右。每100克魷魚鮮品中含蛋白質16-18%，脂肪1-2%，同時含有豐富的維生素及礦物質，是一種營養豐富的水產品。

黑色素(melanin)是一種不溶於水的生物大分子多聚體，它廣泛存在於動植物體內。黑色素一詞來源於希臘語melanos，表示黑暗的意思，由瑞士化學家Berzelius首先提出。黑色素在動植物體內具有防禦、保護功能，在人體內的黑色素亦參加許多生理、病理活動。它還是已知唯一能夠保護生物體免受輻射傷害的天然內源生物聚合體。黑色素還能夠有效的清除活性氧自由基，這些是其保護生物大分子如DNA免受氧化損傷的重要原因。黑色素根據產生前體不同可分為三類：真黑色素以由酪氨酸氧化而成的兩種吲哚結構的分子為前體的，即DHI(5，6-二羥基吲哚),DHICA（5，6－二羥基吲哚酸），其顯深黑色；棕黑色素以Cys-Dopa（半胱氨酸多巴）為前體的，其分子中含有硫，一般顯棕色或者紅色；神經元黑色素以多巴胺（同時含有吲哚和苯丙噻嗪結構）為前體。

液相色譜法微觀分析法是一個在分析黑色素上比較有用的工具。用高錳酸鉀氧化真黑素可以產生PTCA，用氫碘酸還原水解棕黑素可以產生AHP異構體，這兩種物質可以通過液相色譜測定，從而給這種方法奠定了基礎。BorgesCR的研究表明，黑色素和黑色素的降解產品之間存在著定量關係；DHI通過H2O2的氧化作用可以成為PDCA（得率是0.037%），而真黑素中的DHICA通過一些強氧化劑比如（H2O2）的氧化可以生成PTCA（得率是4.8%）,棕黑素中的2-Cys-Dopa通過酸水解可以生成3-氨基酪氨酸（得率是16%），5-Cys-Dopa通過酸水解可以產生4-氨基-3羥基苯丙氨酸（得率是23%）。PDCA，PTCA，2-Cys-Dopa，5-Cys-Dopa可用HPLC測量，然後反推黑色素的含量及結構。

魷魚墨黑色素是從魷魚墨汁中提取出的生物活性成分，即多糖-蛋白複合體，其多糖部分主要由等摩爾比例的葡糖醛酸(Glc A)、N-乙醯半乳糖胺(Gal NAc)和岩藻糖(Fuc)構成，這種黑色素能和蛋白質的交聯起到強化結構的功能；提供一些機械力並保護蛋白質不被降解；黑色素中含有的一些親核性的基團（如-SH，-NH2），使其獲得抗生素特性；它還與許多神經系統的疾病密切相關等。日本還研究出利用魷魚墨黑色素以及檸檬酸等原料，來清除體內殘留重金屬的食品。

魷魚墨黑色素的形成是一個複雜的過程。它是酪氨酸在酪氨酸酶及TRP1，TRP2等一系列的酶作用下最後形成黑色素聚合物。具有以下特性：單體（DHI和DHICA）的高度聚合性、單體間通過橫向和縱向相互連接、聚合度的不均一性、聚合方式隨著外部條件改變而改變。如隨著溶液pH變化，金屬離子，糖，蛋白質等含量的變化，黑色素的聚合方式也發生變化。Christine M R，認為黑色素首先是由一些由5-6個單體聚合而成的平行低聚體通過π電子的堆疊和相鄰低聚體之間的羥基相互作用形成分子量較大的聚合體，該聚合體通過一系列酶的作用繼續聚合，形成了黑色素大分子聚合體。

國際上對於黑色素的研究越來越重視，但是和蛋白質相比，對其結構的研究仍不是非常清楚：在基本構成單元上，蛋白質主要由20種標準氨基酸組成，而真黑色素的基本組成為DHI,DHICA；蛋白質的一級結構主要通過肽鍵，二硫鍵，而黑色素的以及結構的研究還不清楚，可能包括一些橫向和縱向的連接；蛋白質的三維結構包括α-螺旋,β-摺疊，和其他一級基礎上的特殊多級結構，而對於黑色素，其初步合成的一些酶類雖然已經確定，但是和黑色素聚合相關的酶類尚未確定。

從魷魚墨黑色素的紫外光譜分析可以看出，高速離心法提取的魷魚墨黑色素在310nm和410nm附件有兩個明顯的吸收峰，文獻將這兩個吸收峰分別歸屬於DHI的特徵吸收和亞氨基與金屬離子螯合的特徵吸收。而酸解后，魷魚墨黑色素的這兩個吸收峰都明顯減弱，這說明魷魚墨黑色素在酸水解過程中發生了降解。同樣，鹼水解雖然能夠相對較好的保護 310nm 處的 DHI 單元，但是 410nm處的特徵吸收峰的降低說明鹼水解過程中也發生了脫氨基反應。

魷魚墨黑色素的紅外光譜大體上可以作以下歸屬：3200-87500px-1為吲哚和吡咯結構單元中的N-H(~80000px-1)和O-H(~85000px-1)的伸縮。42750px-1為COOH中的C=O伸縮振動；1610-42250px-1為芳香環中C=C和C=N的彎曲以及C=O伸縮(非羧酸集團)；39500px-1為離子化了的COO-的C=O；而31250px-1為酚羥基和羧羥基。另外，73750px-1為烷基中的羧基的伸縮。

黑色素多聚物最顯著的特性是由於其高度的共軛效應而產生的廣譜光吸收特性。他能吸收多數可見光的結果，甚至還包括一些低能量的輻射，並能將吸收的光能量轉化為熱量。最低的能量轉移發生在不成鍵軌道到反鍵軌道的躍遷中，這一情況主要發生在C=O鍵中，而黑色素中有很多這樣的結構。黑色素還吸收紫外區域的光譜，能量從成鍵軌道到反鍵軌道的轉移，這主要發生在不飽和的碳鍵中，由於共軛中的電子離域效應，使得這種由成鍵軌道到反鍵軌道的躍遷更加容易。Rosei等研究了合成黑色素的光譜和光電性質，作為一種合成的多巴黑色素生物聚合體，它與光電導性效應以及電荷傳導性都有關係。

黑色素具有保護體內細胞免受輻射損傷的功能，即光保護作用。Sarna等研究了光照射魷魚墨黑色素產生活性氧族的情況，儘管黑色素在可見光和紫外光區都有吸收，但是在400nm左右處吸收光產生活性氧族較多。而且，隨著聚合度的增加，產生活性氧族的含量減少。黑色素的聚合程度可能就是細胞色素作為光保護劑和光毒素的之間轉換的一個原因。Nofsinger等進行光譜研究發現，聚集度越高，吸收光譜的能級低，越穩定，能吸收光，具有光保護性質，而且黑色素能夠在被光激發后，又很快恢復到基態電子狀態，並且把光轉化為熱量。表明黑色素的吸收光性質和聚合度有重要的關係。Menter等通過體外實驗發現魷魚墨黑色素對脯乳動物的酸溶性膠原蛋白有一定的光保護作用。黑色素能夠有效的提高果蠅在輻射條件下的存活率。同時魷魚墨黑色素已經被成功的用於保護蘇雲金芽胞桿菌生物殺蟲劑，使得其免受陽光紫外線的損害，延長其殺蟲時效。

黑色素有顯著的氧化還原性，這主要是由於在正醌和多聚物兒茶酚部分之間的電子離域，使其產生很多半醌自由基。黑色素可以參與一些單價或雙價的氧化還原反應，並且光吸收的結果使這種色素產生光氧化，使其所含羰基數增加，從而改變黑色素的吸收特性，即所謂即刻色素變黑反應(IPD)。這種光氧化過程產生超氧自由基。

魷魚墨黑色素具有很強的陽離子螯合特性，它主要通過如羧基和去質子化羥基等陰離子起作用。黑色素與金屬離子的結合能夠起著保護細胞的功能。然而，在高濃度的金屬離子下，色素的完整性將會受到影響，這將導致它會釋放出一些可以引起對細胞急性傷害的重金屬離子。比如帕金森患者病人的大腦神經元黑色素中三價鐵離子的含量就比正常人的高，導致Fe(III)代謝不正常。

通過對魷魚墨黑色素溶液研究發現，其溶液中主要存在對苯二酚和苯醌兩種基團。其中：對苯二酚的等電點在9-13之間，苯醌（QI）是6.3。在不同的pH條件下，兩種基團在吸收金屬離子過程中分別起著主導作用。Barbara Bilin′ska等人採用IR分析了Cu2+在不同的pH條件與人頭髮黑色素的絡合波譜圖，發現Cu2+是通過羧基和羥基與不同的黑色素大分子絡合。Bruno Szpoganicz等人分析了Cu2+和Zn2+與膠狀黑色素的絡合位點，並通過電位滴定法分析了這種絡合位點的數量。Jonas Stainsack等人用EPR和FTIR研究了VO2+, Cu2+與合成黑色素的結合，並認為這兩種金屬分別與黑色素上的酚羥基，羧基和亞胺基結合。在魷魚墨中加入一些金屬離子後用SEM（掃描電鏡）和AFM來研究它的結構形態。在和Na(I), Ca(II)，Mg(II)或則Fe(III)等結合，並在雲母上乾燥后，這些含大量DHICA的黑色素顯示了明顯的二維聚合結構。

Liu Y等還對對烏賊墨與金屬離子的結合進行了一系列的研究，結果發現Fe3+和 Mg2+/Ca2+結合在不同的位點；同時采對金屬離子含量對黑色素顆粒的形態的影響進行了研究，發現含不同濃度Fe3+的黑色素形態差異並不大。因此可以認為有機基團和金屬離子間的離子力對已經聚合的天然黑色素分子的表面形態並沒有影響。而對超聲波降解后的烏賊墨黑色素（分子量<10kDa）與金屬離子（Na+, Ca2+，Mg2+和Fe3+）螯合后，用SEM（掃描電鏡）和AFM來研究它的結構形態，發現黑色素顯示了明顯的二維聚合結構，與未與金屬離子螯合的黑色素結構形態差異明顯，這表明金屬離子中幫助建立黑色素三維結構的過程中起了重要的作用。

不同的分離純化方法對保持黑色素的生物活性性質有著較大的影響。黑色素的分離純化主要有四種方法，有水洗法，酶解法，酸水解法以及鹼水解法。水洗法指用雙蒸法重複洗滌以去除蛋白質以及多糖等水溶性雜質，只適合少數含雜質較少的黑色素樣品製備，主要是用於魷魚墨等烏賊屬墨囊黑色素的分離。能夠較好的保持黑色素原有的性質，而不影響其相關的一些活性。酸解法、鹼解法（化學法）是指採用強酸強鹼去除用品中的蛋白等雜質來提取黑色素。但是進來的研究表明強酸處理能夠導致真黑色素脫去羧基，而且容易使蛋白質轉變成色素類似物，而其鹼處理則會使黑色素和一些相關蛋白的化學成分發生變化。Liu Y等人對人的頭髮進行了酶解，酸解和鹼解，發現鹼解和酸解后的黑色素蛋白含量高，而且除去了大部分的金屬離子，並提出酸解，鹼解后的樣品並不是原先的黑色素體，它對研究黑色素的光物性和化學性質來說不是一個可行的提取方法。

酶解法主要通過酶的作用水解作用去除蛋白質，脂質等雜質，這種方法條件相對溫和，能夠保持完整的黑素顆粒形態，是一種比較理想的提取純化黑色素的方法。早期的酶解由於難以找到合適的酶類，主要是酶解和酸鹼處理相結合的方法。1956年，eck et等人採用尿素、木瓜蛋白酶、偏亞硫酸氫鈉從人的頭髮中提取黑色素。Bratosin採用了兩步鹼水解后，再用酶解的方法從老鼠的黑頭髮里分離了黑色素。1981年Arnaud和Bore用蛋白酶PSF2019處理后，再用三步酸水解從頭髮中分離了黑色素。2000年，Prota和他的同伴用先後用蛋白酶K,木瓜蛋白酶和蛋白酶XIV以及Triton-X-100分別處理24h,從人的頭髮和眼球中分離了蛋白質。這是酶法水解提取黑色素的一大突破，被認為是酶法提取黑色素的一個比較成功的應用方法。JohnD.Simon等用膠原蛋白酶處理16h,胰液素處理2h，從牛的眼睛里提取了黑色素，優化了Prota等人的方法。其他影響黑色素的製備的因素還有金屬離子以及乾燥方法等。

不同的乾燥方法會影響到黑色素的多孔性和單位質量表面積，從而可以影響到黑色素的聚集方式，製備黑色素的乾燥方式主要有真空冷凍乾燥，減壓乾燥，噴霧乾燥，CO2超臨界乾燥同的方法，而用的比較多的方法主要是真空冷凍乾燥。

一種魷魚墨黑色素的製備方法，其特徵在於取魷魚墨汁，加入蒸餾水攪拌、洗滌，用粗濾布除去雜物后，用鹼液調pH至5．0－10．0；在攪拌下，加酶水解12－24h，酶解溫度為35－70℃，90－100℃加熱終止反應；用酸液調pH至1．0－5．0，3000－5000×g室溫下離心收集沉澱；所得沉澱物經蒸餾水反覆洗滌、離心，至洗滌水為中性，真空冷凍乾燥。製得的產品純度為30%－99%，提取率為6%－19．9%。

台灣科學家對烏賊屬的黑色素的抗菌和抗氧化能力進行了研究，發現這些黑色素都有一定的抗菌能力，而且，還有一定的抗氧化和光保護能力。黑色素在HIV的預防上面還有重要的作用，可溶性的黑色素可以防止微生物穿過皮膚及粘膜層，並且能夠抑制此種病毒，從而可以減少感染的範圍。Rajaganapathi等人在2000年發現從魷魚幼體的墨的水溶液能夠抑制鼠科白血病病毒的逆轉錄。Fonsecaea pedrosoi（一類真菌病原體）產生的黑色素能夠導致人體產生抗真菌抗體並且能夠增強巨噬細胞的抗菌能力，其他真菌黑色素也能起著抗原的作用。

衰老的自由基理論認為，衰老和衰老相關聯的退化性疾病基本上可以歸因於自由基對細胞成分和連接組織的有害進攻，其中起作用的主要是質子化超氧陰離子和羥基自由基。超氧陰離子是氧毒性的主要因素，是生物體內第一個生成的氧自由基，其他氧自由基都是從超氧陰離子衍生出來的。雖然它氧化作用不是最強，但它存在壽命長，擴散的距離長。而羥基自由基的是氧化性最強的氧化劑，可以與所有生物大分子反應。

魷魚墨黑色素是一種良好的自由基清除劑，是所知的唯一保護生物體免受輻射傷害的天然內源生物聚合體。它能夠有效清除羥基自由基，氧自由基等自由基。人大腦神經元中的黑色素是一個三價鐵離子儲存庫。帕金森患者病人的大腦中，伴隨著三價鐵離子水平的升高以及神經元黑色素的缺失，往往會造成神經細胞的死亡。在正常的人腦細胞中，神經元黑色素與鐵離子的螯合量少於最大螯合量的一半，剩餘未與鐵離子螯合的神經黑色素起到人腦細胞抵抗鐵離子的毒害的作用。然而，不正常的鐵離子的新陳代謝可以導致神經元黑色素吸收過多的鐵離子。在黑人黑質神經細胞中，神經元黑質中飽和的鐵將導致產生一種遊離鐵，它能夠催化非酶氧化反應，特別是一種高效的氧化反應，如H2O2氧化成羥基自由基（·OH）。魷魚墨黑色素與鐵螯合以後，其抗氧化活性明顯下降，這可能是黑色素與三價鐵螯合時發生了氧化還原反應，發生對二苯酚/苯醌結構轉換而失去電子，從而降低了其清除自由基的活性。

除此之外，Rita de Cássia從黑麴黴中提取黑色素並研究了其抗氧化活性。發現它能有效的清除 HOCl 和 H2O2氧化產生的自由基。RM.I.Blinovaa 等研究了黑酵母黑色素對人角化細胞和纖維原細胞的生長的影響，發現黑色素能夠抑制角化細胞的生長。我國科學家也對黑色素的自由基清除活性進行了研究，李曉燕等的研究發現，工程菌產生黑色素在低劑量時的抗氧化能力強於其它幾種常用的抗氧化劑。黑色素還能夠與一些抗生素類藥物，減少此類藥物對人體的損傷作用。Rainer Knorle等研究了黑色素與藥物的結合的親和動力學，並且發現黑色素能夠有效減緩此類藥物帶來的對小鼠的損傷。