反義技術

反義寡核苷酸是一類經人工合成或構建的反義表達載體表達的寡核苷酸片段，長度多為15-30個核苷酸。根據結合部位的不同分為反義DNA（asDNA）、反義RNA（asRNA）、自催化性核酶（ribozyme），後者為具有酶活性的反義分子，可裂解與其互補的mRNA及在DNA內插入DNA片段構成三鏈結構，但最常用的為反義寡脫氧核苷酸（反義寡核苷酸），其優點在於其理論上的高度靶特異性（鹼基互補）、設計容易、多樣且合成簡單及高度的局部性和針對性。這都是常規藥物設計、生產和作用所不可比擬的，因而具有巨大的吸引力和研究價值。傳統藥物大多與蛋白質結合，從而修飾蛋白質的功能。相比之下，反義試劑在mRNA (DNA)水平上發揮作用，阻止其翻譯成蛋白質。最近幾年來，新的用於保護寡聚核苷酸免遭酶解、提高靶標親和性的化學修飾技術的發展，使得反義技術也獲得巨大進步。另外，RNA干擾（RNA interference）成為第三代抑制哺乳動物細胞基因表達的高效方法，該技術採用了21-23個殘基組成的小干擾RNA分子（siRNA）。

反義技術具有明顯的優點：

（1）反義核苷酸是針對特定的靶mRNA（DNA）的序列設計合成，具有極高的特異性；

（2）反義核酸是針對已知序列的靶基因設計合成的，由於靶基因序列已知，反義核酸僅有15-30個鹼基，結構簡單，容易設計和體外大量合成。

（3）反義核酸進入細胞內與細胞周期無關，既可進入增殖期細胞又可進入非增殖期細胞。

（4）反義寡核苷酸不含病毒序列，不會產生免疫反應，也不會整合入宿主染色體內

確定靶基因后，針對該基因的外源反義核酸片段的設計合成有兩種途徑：

（1）重組於表達載體產生反義核酸片段，即利用DNA重組技術，在適宜的啟動子和終止子間反向插入一段DNA於質粒中，構建於反義表達載體來合成反義核酸；

（2）人工合成反義寡核苷酸，即根據選定的靶基因序列，按照鹼基互補原則，設計出反義寡核苷酸序列，以DNA自動合成儀進行合成。

（1）反義核酸在體內是穩定的；

（2）反義核酸必須能夠進入細胞內，並與靶基因有較高的親合力，且在作用濃度下不表現出明顯的細胞毒性；

（3）與靶序列的雜交能使靶基因的表達受抑制，且不作用於其它核酸序列及胞內蛋白和類脂化合物。

為使反義核酸序列只作用於唯一的靶基因，其最短序列應是12-15個鹼基，實驗中的反義核酸多是15-30個鹼基。增加反義核酸序列的長度可以提高其結合能力及雜交複合體的穩定性，但同時也增加了與其它mRNA非特異性同源序列結合的機會，並使其進入細胞內的能力降低。

大部分反義核酸是在胞漿內與靶基因序列作用而形成雜交複合體的，所以靶基因（mRNA）中二級結構少或無的區域，也就是mRNA啟動子周圍的序列，是反義核酸的理想作用位點。對於核內的mRNA，參與其加工和外運的序列以及剪接位點處的序列是有效的靶基因序列。另外，5’-帽端是多數起動子的結合位點，也是有效的靶基因區。

反義技術的一個重大挑戰是寡聚核苷酸的穩定性，因為未經修飾的寡聚核苷酸在生物體內會被核酸酶迅速降解。反義實驗中應用到大量的化學修飾的核苷酸。一般來說，核苷酸的修飾分為三類：非天然鹼基的類似物、經過修飾的糖（尤其是核糖的2'位置）、改變的磷酸骨架。

硫代磷酸酯寡聚脫氧核糖核酸（Phosphorothioate DNA Oligonucleotides，PS DNA ON）是第一代DNA類似物的主要代表，被認為是至今為止了解最多和應用最廣泛的反義寡聚核苷酸。在這一類寡聚核苷酸中，磷酸二酯鍵中的非橋氧原子被置換成硫原子。PS DNA ON的主要缺點是能與一些蛋白結合，這可以引起細胞毒性。但從藥物動力學角度來看卻是有利的。與血漿蛋白的結合可以保護它們免遭過濾，使得它們在血清中的半衰期延長。PS DNA ON的另外一個缺點是與互補RNA的親和性會稍微降低與硫代磷酸酯寡聚脫氧核苷酸相關的問題在第二代寡聚核苷酸中得到一定程度的解決。第二代寡聚核苷酸在核糖的2'位置含有烷基修飾。2'-O-甲基和2'-O-乙基是這類修飾的兩個重要成員。具有這種修飾的寡聚核苷酸比硫代磷酸酯DNA的毒性低，並且與互補RNA的親和性也得到了稍微提高。然而這些有利的性質被2'-O-烷基RNA不能激活RNaseH切割靶RNA這個缺點所抵消。

最近幾年，有多種經過修飾的核酸被開發，用於提高靶標親和性、核酸酶抗性和藥物動力學性質。“構像限制”的概念被廣泛用於提高親和性和生物穩定性。這些新類型的核酸被歸為“第三代”反義試劑。

為提高反義核酸的局部轉染率，使其最大量地進入細胞內，可通過一定運載系統將外源反義核酸通過上述方法轉移至局部細胞。常用載體有：

（1）脂質體：將反義核酸的負電荷包裹后形成更易穿過細胞膜的脂溶性複合體，可明顯提高細胞的攝取能力，常用的脂質體為陽離子脂質體，如DOTMA和DOTAP。

（2）病毒脂質體運載系統：可明顯提高轉染率。

（3）病毒：主要有逆轉錄病毒和腺病毒，前者主要作用於增生期細胞，轉染率低，但與宿主細胞核的整合能力強，整合后穩定性強，可持續表達五個月以上；後者目前研究較多的是複製缺陷腺病毒，可作用於增殖期和靜止期細胞，轉染率高，但整合能力和穩定性均較低，其細胞毒性和免疫反應及感染生殖腺細胞限制了其在體內的應用。

（4）其它：如受體介導等，目前應用尚不廣泛。

對於體外人工合成的反義寡核苷酸，主要應用脂質體、病毒脂質體運載系統或不用載體而直接局部給葯，對於應用基因重組方法構建的反義核酸表達載體，可用脂質體或病毒載體一次性給葯，使其進入細胞內后不斷產生反義核酸（細胞增殖時表達），達到長期抑制的目的。

反義核酸的吸收取決於其序列長度、荷電量、水/脂溶性及其濃度。熒光吖啶標記的未修飾的核酸是通過受體介導的細胞內吞作用進入細胞內的，且已分離出分子量分別為34KD和80KD的兩種膜表面蛋白。對於修飾過的反義核酸，其主要吸收機制有所不同，但多數細胞表現為溫度及能量依賴性的細胞顆粒內吞作用，37℃時吸收量最大。核素及熒游標記的反義核酸在大多數細胞中先以顆粒形式內化（Internalization）於內吞小泡中，後期可達細胞核內。

反義寡核苷酸抑制靶基因表達的確切機制尚不完全清楚。一般認為有特異性和非特異性機制兩種。

特異性機制是指反義寡核苷酸與靶序列結合后通過以下途徑抑制靶基因的表達：

（1）與DNA結合成三鏈結構或與單鏈DNA結合成雙鏈結構以阻止靶基因的複製或轉錄；

（2）與靶mRNA結合形成雙鏈雜交體激活核酸酶H，裂解靶mRNA阻斷蛋白質的翻譯；

（3）與mRNA AP位點結合干擾其剪接、加工和運輸以終止蛋白質的翻譯；

（4）佔據酶結合位點，表達核酶，降解靶mRNA。

非特異性機制指非序列特異性藥理學效應，或與細胞蛋白間反應，為許多雙鏈核酸所共有，如雙鏈RNA（dsRNA）增加IFN的合成，激活兩種IFN誘導基因：2’，5’-寡腺苷酸合成酶（2’，5’-AS）和蛋白激酶P60。前者激活核酸內切酶RnaseL降解靶mRNA，後者使真核細胞起始因子2（CIF-2）的α亞單位磷酸化導致啟動mRNA的翻譯失敗，從而抑制蛋白質的合成。dsRNA尚能活化腺苷酸環化酶使cAMP濃度升高。另外，尚有dsRNA誘導內皮細胞IL-1α表達的報道。

當然，反義寡核苷酸的非特異性效應有可能導致細胞毒性。體外大多數細胞能耐受100μmol/L濃度的反義寡核苷酸。

反義核酸的細胞毒作用與核酸的化學修飾基因、序列長度及作用濃度和時間有關。一般而言，核酸序列愈長、作用濃度愈大、時間愈久，毒性作用愈大。有關反義核酸在體內的毒性研究較少，靜脈或腹腔注射硫代磷酸核苷酸后，在體內迅速再分佈，T1/2≈10-60分鐘，主要經過尿液排泄，清除時間較長，約20-40小時，這表明可以不必大量反覆用藥即可使靶組織中具有一定治療濃度的反義核酸。然而，反義核苷酸可在如心、胃、腸等臟器中明顯聚集，這些非靶器官中集聚的反義核酸可產生非特異性地蛋白合成抑制作用，尤其是對骨髓和小腸等增生旺盛的器官；同時寡核苷酸降解后剩餘的化學修飾鹼基有摻合入DNA而引起突變或干擾DNA修復的可能。而局部應用反義核苷酸可明顯減少其對遠處組織的毒性作用。

反義技術應用廣泛，可以用於治療多種疾病，包括病毒感染、癌症和炎症（總結如下表）。

Product Company Target Disease Chemistry Status

Vitravene (Fomivirsen) ISIS Pharmaceuticals CMV IE2 CMV retinitis PS DNA Approved

Affinitac (ISIS 3521) ISIS PKC- Cancer PS DNA Phase III

Genasense Genta Bcl2 Cancer PS DNA Phase III

Alicaforsen (ISIS 2302) ISIS ICAM-1 Psoriasis, Crohn's disease, Ulcerative colitis PS DNA Phase II/III

ISIS 14803 ISIS Antiviral Hepatitis C PS DNA Phase II

ISIS 2503 ISIS H-ras Cancer PS DNA Phase II

MG98 Methylgene DNA methyl transferase Solid tumors PS DNA Phase II

EPI-2010 EpiGenesis Pharmaceuticals Adenosine A1 receptor Asthma PS DNA Phase II

GTI 2040 Lorus Therapeutics Ribonucleotide reductase (R2) Cancer PS DNA Phase II

ISIS 104838 ISIS TNF Rheumatoid Arthritis, Psoriasis 2nd generation Phase II

Avi4126 AVI BioPharma c-myc Restenosis, cancer, Polycystic kidney disease 3rd generation Phase I/II

Gem231 Hybridon PKA RI Solid tumors 2nd generation Phase I/II

Gem92 Hybridon HIV gag AIDS 2nd generation Phase I

GTI 2051 Lorus Therapeutics Ribonucleotide reductase (R1) Cancer PS DNA Phase I

Avi4557 AVI BioPharma CYP3A4 Metabolic redirection of approved drugs 3rd generation Phase I

1998年，第一個（也是至今為止唯一的一個）反義藥物Vitravene（Fomivirsen）被美國FDA批准通過。這種硫代磷酸酯DNA被注射入玻璃體內，以治療由巨細胞病毒（Cytomegalovirus）引起的艾滋病人的視網膜炎。Vitravene獲得批準是參與反義領域的公司的一個里程碑。這種藥物滿足了感染者的需要，但是它的用處非常稀少，以至於只為ISIS製藥公司（USA）和Novartis公司（Switzerland）2001年帶來了15萬7千美元銷售收入。

一些第二代寡核苷酸達到了臨床試驗階段。抗TNFa的ISIS 104838正被用於治療炎症的實驗，比如風濕性關節炎和牛皮癬。Hybridon公司（USA）正在嘗試利用第二代反義分子治療癌症和艾滋病病毒感染。核苷之間由硫代磷酸酯鏈接、兩端為四個2'-O-甲基核苷酸組成的混合骨架寡核苷酸被證明口服后在小鼠中有抗腫瘤活性。

現在用的最廣泛的反義分子仍然是硫代磷酸酯寡聚脫氧核苷酸，但是一些第二代和第三代化學分子正在進行實驗並且看來將提供更好的藥物動力學性質和口服給葯的機會。

總的來說，越來越多的反義寡核苷酸進入不同階段的臨床研究，並且涉及到越來越多的疾病，但目前仍存在一些問題亟待解決，一是反義技術的應用方面，包括：

（1）對反義核苷酸的化學修飾以提高其穩定性，延長其半衰期，增加其作用時間；

（2）反義核苷酸的轉移系統，尤其是局部腔內轉移系統，包括載體系統的研究，使其靶組織最大效率地吸收反義核酸，以提高其作用效果；

（3）反義核酸作用機制的研究。

二是在臨床水平，主要是反義核酸的應用劑量和作用時間及對降解產物毒性的作用研究，靶基因的選擇及應用反義核酸的最佳時間。

總之，反義技術是一很有前途的基因治療方法。第三代核苷酸中的一些已經被成功的應用於體內。在研究中已顯示出極好的臨床應用前景，對以上問題的解決將使其日臻完善，為更多疾病提供有力的臨床可行的治療手段。

隨著分子生物學和遺傳工程的發展，基因治療應運而生，反義技術是其中一種，它的基礎是根據核酸雜交原理設計針對特定靶序列的反義核酸，從而抑制特定基因的表達，包括反義RNA、反義DNA及核酶（Ribozyme），它們通過人工合成和生物合成獲得。

（一）反義RNA，根據反義RNA的作用機制可將其分為3類：Ⅰ類反義RNA直接作用於靶mRNA的S D序列和(或)部分編碼區，直接抑制翻譯，或與靶mRNA結合形成雙鏈RNA，從而易被RNA酶Ⅲ 降解；Ⅱ類反義RNA與mRNA的非編碼區結合，引起mRNA構象變化，抑制翻譯；Ⅲ類反義RNA則直接抑制靶mRNA的轉錄。

(二)反義DNA是指一段能與特定的DNA或RNA以鹼基互補配對的方式結合，並阻止其轉錄和翻譯的短核酸片段，主要指反義寡核苷酸，因更具藥用價值而倍受重視。

(三)核酶(ribozyme)是具有酶活性的RNA，主要參加RNA的加工與成熟。天然核酶可分為四類：(1)異體催化剪切型，如RNaseP；(2)自體催化的剪切型，如植物類病毒、擬病毒和衛星RNA；(3)第一組內含子自我剪接型，如四膜蟲大核26SrRNA；(4)第二組內含子自我剪接型。利用反義技術研製的藥物稱反義藥物。反義藥物作用於產生蛋白的基因，因此可廣泛應用於多種疾病的治療，如傳染病、炎症、心血管疾病及腫瘤等。與傳統藥物比較反義藥物更具選擇性及效率，因此也更高效低毒。基於上述特點反義藥物已成為藥物研究和開發的熱點。而且反義技術還可以應用於生物科學的基礎研究。