棉酚

棉酚:

中文名稱：棉酚

分子式：C30H30O8

分子量：518.55

英文名：gossypol

規格：98%（慈緣生物）

CAS ：303-45-7

棉酚的作用部位在睾丸生精上皮，以精子細胞和精母細胞最為敏感。由於破壞了生精上皮，從而導致

精子畸形、死亡，直至無精子。臨床上男性服藥4個月後均出現無精子或極少精子，且不活動；停葯后藥效可持續3～5周，以後逐漸恢復生育功能。甲酸棉酚和醋酸棉酚均能保持抗生育活性，且副作用略有降低。棉酚右旋體無效，左旋體為活性成分，因此，左旋棉酚的作用為棉酚的2倍。該品除用作口服男用避孕藥外，還可作外用殺精子劑；還用於治療婦科疾病，包括月經過多或失調、子宮肌瘤、子宮內膜異位症等

。

棉酚口服后，藥物在體內的分佈廣泛，由於它難以通過血腦屏障及血睾屏障，以致在腦組織中或睾丸內的濃度極低。而幸運的是：①睾丸的生精上皮對藥物的反應極敏感，因此，在對一般組織不至於產生明顯毒性作用的劑量下，即可達到抗生育的作用。

②藥物在體內的代謝緩慢，完全消除需要20天左右的時間或更長，也就是說，一它在體內有一定的積蓄作用。故開始時藥物用量較大，且需持續使用，待生效后可改用較小劑量維持。

棉酚的用法：片劑，每片含 20 毫克。初起每天20～30毫克，一般持續60～80天才能見效，通常藥物起效的總量為1～2克，此後可改為每次 15～40毫克，每周服 2次維持。由於個體對 藥物反應的差異較大，用藥過程中，特別是最初階段，應作好精液監測，根據 精子計數情況調整用藥劑量，以用最低的有效劑量為宜；通過監測還可確定其生效時間。

棉酚使用中存在的主要問題；

①低鉀血症，棉酚可以促進腎臟組織合成前列腺素及抑制鉀一鈉三磷酸腺成酶的活性，降低腎臟保留鉀的

能力，從而導致低鉀血症。使用中必須熟悉低鉀血症的臨床表現，及時發現與處理，以便杜絕不良後果，有條件者應定期監測血鉀的水平。

②永久性無精子症，棉酚可致生精上皮萎縮，然而個體間的差異很大，有些人用後生精上皮的形態不發生明顯的變化；有少數人卻可發生明顯萎縮。部分損害時仍有可能恢復生育力，但若全部受損則不能恢復，而造成永久性不育。事先不能預測其發生；一旦發生后，又無有效的治療方法，故預防其發生非常重要。建議連續用藥時間最長為2年，以後改用其它避孕方法，並觀察精子計數恢復的情況。若希望重複用藥者，必須等待精子計數恢復正常后再用。

（1）主要有低血鉀、肌無力、嗜睡和性慾減退。長期應用可能產生對睾丸功能的不可逆性影響。（2）服藥前有精索靜脈曲張的病人在服用棉酚后特別容易發生生精上皮長期或永久性損傷，故需要恢復生精功能的服藥者，應預先檢查診斷。（3）如發生低鉀血症，可口服或靜脈補充鉀鹽，氯化鉀每次1mg，1日3次。（4）心、肝功能不全和血鉀偏低者慎用。

目的建立棉花根皮中棉酚的提取工藝並對工藝進行了優化。方法利用乙醚超聲萃取法提取棉花根皮中

的

棉酚，洗滌、濃縮得到棉酚粗產品；研究了各種實驗條件對棉酚產率的影響，採用分光光度法測定該成分含量，作為評價指標。結果最佳工藝為超聲提取法。冷浸1h，料液比（g·cm-3)1∶2。5，超聲提取3次，料液比1∶1，15min/次，溫度為15℃以下。結論超聲提取工藝具有節能、省時、效率高的優點。

棉根皮，錦葵科植物棉花的乾燥根皮，有補氣、止咳、平喘功能，用於慢性支氣管炎、體虛浮腫、子宮脫垂等。棉根皮中含棉酚（gossypol)1。5%～2。5%，並含天冬醯胺及少量揮髮油等。棉酚為多羥基酚類化合物，為男性抗生育與抗腫瘤的有效成分[1，2]。為了充分利用這一優勢資源，本文以棉酚為考查對象，對棉根皮中的棉酚進行提取，並優選出棉酚的最佳提取工藝。

1、儀器與試劑

新鮮陸地棉根皮（采於新疆農八師145團場，經石河子大學棉花研究所孫傑所長鑒定）、乙醚、亞硫酸氫鈉（均為分析純）、棉酚標準品（SIGMA公司）、KQ5200B型超聲波清洗器、RE?85A真空旋轉蒸發儀、UV762可見/紫外分光光度計、分析天平、容量瓶等。

2、方法與結果

2。1標準溶液的製備及標準

曲線的繪製稱取50mg棉酚標準品，置於50cm3的燒杯中，加入乙醚溶解並轉移到50cm3容量瓶中，稀釋至

刻度，得到1mg·cm－3棉酚溶液。取該溶液2。5cm3，置於50cm3的容量瓶中，加入純乙醚稀釋至刻度，得到50μg·cm－3棉酚溶液。分別吸取0，0。l，0。2，0。4，0。8，1。6，2。4cm3棉酚標準液，置於10cm3的容量瓶中，加入純乙醚稀釋至刻度，混勻，靜置5min，即得標準溶液（2001湖南大學碩士學位論文，余虹宇《醋酸棉酚的製備》）。

將上述稀釋了的棉酚標準溶液在360nm下進行比色測定，繪製標準曲線（見圖1），遊離棉酚濃度C（μg·cm－3）與吸光度A呈線性關係，得回歸方程：A=0。0314C－0。001，r=0。9997。

2。2棉酚提取基本工藝流程見圖2。

2。3提取工藝優選

2。3。1棉酚提取方法

冷浸法：稱取棉根皮粉末5g，加入乙醚12。5ml，密封，冷浸12h，抽濾，濾渣再冷浸1h，用溶劑10ml，二次抽濾，合併濾液，減壓濃縮至10ml。

迴流法：稱取棉根皮粉末5g，加入乙醚12。5ml，迴流提取4h，抽濾，減壓濃縮至10ml。

先冷浸后超聲法：稱取棉根皮粉末5g，加入乙醚12。5ml，先冷浸1h，然後超聲提取3次，用溶劑8ml/次，時間15min，抽濾，合併濾液，減壓濃縮至10ml。

2。3。2提取方法的比較將上述實驗結果進行比較，結果見表1。表13種提取方法結果的比較（略）

顯然，先冷浸后超聲法所得提取物中的棉酚含量明顯高於冷浸法和乙醚迴流法。

2。3。3棉酚提取最佳工藝根據棉酚的理化性質，考慮到提取過程中的超聲使用次數（先冷浸后超聲）、料液比、實驗溫度、乙醚萃取次數等因素對提取的影響，每個因素選擇3個水平，以L9(34）正交表（見表2）進行實驗研究，從而優選最佳提取工藝。表2L9(34）正交設計因素水平（略）

實驗方法及實驗數據：準確稱取棉根皮粉末10g，分別根據正交設計因素水平表的實驗條件按2。3基本工藝流程進行實驗，把最後的合併液轉移到100ml的容量瓶中，用乙醚定容，混勻，精密取1ml置50ml容量瓶中，用乙醚定容，混勻，再精密取1ml至10ml容量瓶中，用乙醚定容，混勻，按2。2測定棉酚的含量，並計算，正交實驗結果見表3。表3正交實驗結果（略）

結果分析：根據各因素的影響來看，其影響大小順序是B>A>D>C，即料液比>；超聲次數>；實驗溫度>；乙醚萃取次數。因此，可知最佳工藝為A2B2C1D3。即加2。5倍乙醚，先冷浸后超聲3次，控制溫度在15℃以下，乙醚溶劑萃取3次，從方差分析可知因素B具有顯著性影響。

3、討論

以棉酚為考查對象，對棉根皮中的棉酚進行提取工藝研究。實驗結果表明，最佳工藝為超聲提取法。最佳條件是：冷浸1h，料液比（g/ml）1∶2。5，超聲提取3次，15min/次，溫度為15℃以下。

棉酚作為一種公認的男性節育葯，已受到國內外學者廣泛關注。然而棉酚可能是一種頗有前途的抗癌藥物卻未被多數學者所認識。自60年代初至今已有不少有關棉酚抗腫瘤作用的報道、其中涉及棉酚抗腫瘤機制以及體外培養的腫瘤細胞、人腫瘤的動物模型和臨床應用等研究。以下對棉酚的抗腫瘤研究進展作一綜述。

棉酚是一種黃色的酚類化合物，天然存在於錦葵科的某些植物中，其化學結構由Adams等於1938年闡

明，為2.2′聯二萘-8,8′二羥基醛-1,1′，6.6′7.7′六羥基-5,5′二異丙基-3-3′二甲基，分子量518.54。棉酚有兩種光學異構體，先從棉簇植物中分離出消旋體，然後從桐棉植物中分離出右旋體，再從海島棉提出左旋體。研究提示消旋棉酚對黑色素瘤細胞系SK-mel-19和SK-mel-28作用相等，IC50=22μmol/L。左旋棉酚IC50=4μmol/L，對細胞的敏感性是消旋棉酚的5倍多。右旋棉酚無生物活性，消旋棉酚的細胞殺傷作用可能在左旋的異構體部分，左旋棉酚效果好，毒副反應小。棉酚製劑主要有3種：精製棉酚、醋酸棉酚和甲酸棉酚。棉酚口服后僅部分被腎和小腸上皮吸收。吸收后大部分於膽汁分泌，其主要代謝場所是肝臟。同位素標記棉酚的生物半衰期為48小時，心、脾、腎、腎上腺、垂體、肌肉和睾丸等組織放射高峰見於4～9天。給葯后1天，組織積貯總量為投入劑量的12.5%，此時除腸道內容物所含放射性最高外，各組織活性依次為：胃、腸道、肝、心、腎、脾、肺、血、肌肉、脂肪、睾丸和腦。

一抗增殖

拓撲異構酶可改變DNA拓撲性質，在DNA生物合成中起重要作用。研究提示，棉酚抑制拓撲異構酶Ⅱ的催化激活和干預拓撲異構酶-DNA複合物形成的穩定性，影響細胞的功能。棉酚降低DNA聚合酶α和β的活性，抑制DNA合成，導致細胞在S期中止，是一種特異的DNA合成抑製劑，在較大劑量下抑制細胞分裂。

Rb蛋白和cyclinD1蛋白調節細胞由G1期進入S期。磷酸化的Rb蛋白在細胞靜止期G1期通過E2F轉錄因子促進細胞進入S期。cyclinD1能抑制Rb蛋白作用的失活。乳腺癌細胞系MCF-7高表達磷酸化的Rb蛋白。Blackstaffe等報道流式細胞計數示10μmol/L的棉酚中止MCF-7細胞繫於G1/S期，抑制DNA合成。Western blot分析提示，棉酚以劑量依賴方式調低Rb蛋白和cyclinDl蛋白的表達，降低磷酸化與非鱗酸化的Rb蛋白的比例，抑制細胞生長。

Northern blot分析提示，棉酚可調低膀胱癌細胞系BT5637的c-myc基因表達。阻斷癌細胞由G0/G1期進入S期，降低DNA含量，改變線粒體的結構，抑制腫瘤細胞生長。

二干預信號傳導通路

⒈干預第一信使

Shidaifat等通過核糖核酸保護法發現，棉酚對前列腺癌細胞系PC3的轉化生長因子β1(TGF-β1）的表達有刺激作用。3H-Tdr摻入分析示棉酚作用於TGF-β1基因的表達，抑制細胞DNA合成和中止細胞於G0/Gl期[2,4]。

激素是信號傳導通路中重要的第一信使。組織的生長、發育受激素的控制，當組織癌變時，往往會部分地保留與原組織相似的激素依賴性。棉酚可改變體內激素水平，阻斷異常的信號傳導，控制腫瘤的生長。臨床應用棉酚治療子宮肌瘤，用藥前後血雌激素水平有顯著性差異，故認為棉酚可能抑制卵巢功能促使血E2濃度下降，局部組織中濃度也下降，肌瘤縮小。

⒉干預第二信使

蛋白激酶是一類使蛋白質發生磷酯化的酶，蛋白激酶、磷酸酶信號傳導系統是細胞外信息向細胞內傳遞的主要機制和最後公共通路。棉酚干預蛋白激酶的功能，調控信號傳導通路，調節細胞的增殖和分化，阻止腫瘤的發生和發展。

研究表明，棉酚作用於蛋白激酶C（PKC）催化區域的ATP結合部，作為非特異的PKC抑製劑作用於HL-60白血病早幼粒細胞系6小時后，凋亡的DNA片段增多，並有濃度依賴性。棉酚包含親脂性的非極性區域，這些區域通過與PKC的催化片段結合，引起組蛋白磷酸化抑制，從而抑制PKC。在淋巴肉瘤細胞系Nb2中，PKC抑製劑抑制PRL刺激的細胞分裂。實驗證明，棉酚抑制鳥尿酸脫羧酶激活的PRL刺激的細胞分裂，降低3H-Tdr摻入DNA比例，導致DNA合成的下降和細胞分裂的抑制。棉酚的抑制濃度與其它PKC抑製劑相符。

磷酸肌醇信號傳導系統中，第二信使二醯甘油（DG）是PKC的內源性特異激活劑，磷脂代謝的其他產物如順式非飽和脂肪酸，包括油酸、亞油酸、亞麻酸、花生四烯酸等，可增強DG對PKC的激活，與PKC也有關。

通過放射免疫分析發現，棉酚是花生四烯酸5-和12-脂氧合酶的抑製劑。棉酚抑制花生四烯酸釋放作用可能是通過抑制鱗脂酶，導致前列腺素E2合成的抑制，引起磷脂代謝改變，調節磷酸肌醇信號傳導。McManus等提出在C6神經膠質瘤細胞系中，棉酚是脂氧合酶（LD）和細胞色素的抑製劑，阻止腫脹誘導的牛黃酸肌醇流出，抑製劑量敏感的陰離子通道，干預花生四烯酸代謝，阻止磷酸肌醇信號傳導。

三干預能量代謝和鱗脂代謝

棉酚能抑制細胞能量代謝，通過乳酸脫氫酶（LDH）同源酶Ⅴ型抑制線粒體氧化鱗酸化和電子傳遞。艾氏腹水瘤細胞系的能量代謝顯示，高濃度的棉酚抑制氧消耗和ATPase的活性，減少糖酵解，誘導NAD+和細胞色素b的氧化狀態，抑制細胞能量代謝，導致細胞死亡。艾氏腹水瘤細胞和肉瘤S-180細胞中加入棉酚，發現ATP/Pi及PCr/ATP均下降，表明棉酚有阻斷細胞能量代謝作用。Hutchinson提出棉酚可引起磷酸單脂、雙脂水平下降及輔酶Ⅰ、Ⅱ上升，抑制細胞能量代謝。

超微結構研究表明，棉酚引起線粒體腫脹，嵴斷裂、固縮、嚴重空泡化及潰破等。線粒體是細胞呼吸、能量供應和氧化、磷酸化的重要細胞器，線粒體損傷導致細胞死亡[10，11]。

此外還有一些棉酚的抗腫瘤機制，如某些對烷化劑耐葯的腫瘤細胞系，其機制是因為增加了谷胱甘肽S-轉移酶活性，從而加速藥物滅活。抑制谷胱甘肽氧化還原系統的某些酶可影響細胞對烷化劑的敏感性。棉酚對谷胱甘肽轉移酶及其pi同功酶表現強有力的抑制，與烷化劑合用，可增加其抗癌功能。耐葯與非耐葯MCF-7細胞系培養中，棉酚的DNA合成抑制活性相同。

體外實驗表明棉酚對起源於淋巴及粒細胞、腎上腺、乳腺、宮頸、直腸和中樞神經系統的多種腫瘤細胞株均有明顯的增殖抑制活性[13，14]。

Coyle等予棉酚30mg/kg管飼法處理中樞神經系統BRW祼鼠動物模型，每周5天，共4周，腫瘤的平均瘤重是對照組的50%。鼠皮下接種前列腺癌細胞系MAT-LyLu，立即予棉酚治療，2周後用葯組前列腺腫瘤重量是對照組的76%，淋巴轉移和肺轉移為20%，對照組分別為40%和60%，睾丸的睾酮水平明顯下降。左旋棉酚單劑量15mg/kg能減少移植胰腺癌的小鼠中腫瘤ATP含量和血流，使腫瘤ATP/Pi下降50%，血流下降60%。

臨床應用醋酸棉酚治療子宮肌瘤與安宮黃體酮對照，發現棉酚組39例總有效率87.18%，對照組50%。1972～1977年，上海、江蘇、浙江協作組對棉酚片治療358例惡性腫瘤進行分析，發現對腎、肺、肝癌療效較好，腫瘤病灶。國外報道18例腎上腺癌患者口服棉酚30mg/d～70mg/d超過6周，其中3例對其它化療藥物無反應者腫瘤縮小50%以上，緩解期維持數月至1年以上；1例反應輕微，1例無變化，13例病情進展。27例神經膠質瘤複發患者口服棉酚20mg/d，2例部分有效，1例無變化。

經過近40年的努力，對棉酚抗腫瘤的探索無論在實驗室研究還是臨床試用方面，都取得令人鼓舞的進展。由於棉酚的毒副反應主要表現為低血鉀症，且總發生率為1%左右，故隨著對棉酚抗腫瘤機制進一步全面的認識和實驗室研究及臨床試用的深入，棉酚可能成為一種頗有前途的抗腫瘤藥物。

目的：通過醋酸棉酚（GAA）對經典白血病細胞系HL60的研究，探索GAA治療白血病的可能性。方法：用細胞培養、四唑鹽比色試驗（MTT）、細胞形態學、DNA電泳及NBT還原試驗等方法觀察不同濃度GAA促進HL60細胞凋亡及誘導分化的作用。結果：GAA在濃度>6μmol/L時可顯著抑制HL60細胞的增殖，促進其凋亡，並表現出劑量效應；在誘導分化濃度下（1，4μmol/L），GAA可促進HL60細胞向成熟粒細胞分化(P<0。05)。結論：GAA對白血病細胞HL60的選擇性促凋亡作用表明其可能是一種理想的高效低毒抗白血病藥物。

材料：人急性白血病HL60細胞系由本室保存。正常人單個核細胞（PBMNCs）來自第四軍醫大學西京醫院輸血科正常獻血員供血離心白細胞層。RPMI1640（Gibco公司）；胎牛血清（FBS，杭州四季青生物工程材料研究所）。GAA、四唑氮藍（MTT）及硝基藍四氮唑（NBT）購自Sigma公司。電子顯微鏡（日本JEOL公司）；酶聯免疫檢測儀（美國BioRad公司）；流式細胞儀（美國BeckmanCoulter公司）。

目前臨床用於白血病的化療藥物包括烷化劑、抗代謝葯、抗生素及激素等。這些藥物不僅毒副作用較強，對骨髓抑制作用明顯，而且在長期使用後會逐漸產生耐藥性，導致治療失敗。作為天然藥物的棉酚具有顯著的抗實體瘤作用，且副作用較小。體外研究提示該藥物對多種腫瘤細胞系有著明顯的抗增殖和抗轉移作用，如乳腺癌、直腸癌、肝癌、黑素瘤等。在24h以上的細胞存活實驗中，對於黑素瘤，棉酚的活性要大於順鉑、馬法蘭、達卡巴嗪等。還有人將該藥物用於治療進展期的膠質瘤和難治性腎上腺癌、乳腺癌等患者，均取得了令人滿意的效果，但均缺乏進一步的深入研究［4］。棉酚口服後部分被小腸吸收，大部分經膽汁分泌，主要代謝場所是肝臟。其生物半衰期為48h，各組織活性依次為胃腸道、肝臟、心臟、腎臟、血液、肌肉等。因此，口服棉酚后能維持較長時間的有效血葯濃度［8］。提示棉酚比多數經典的化療藥物有著更顯著的抗腫瘤活性，很有希望應用於臨床治療白血病。我們的結果表明，GAA在＞6μmol/L的濃度範圍對HL60細胞有著顯著的抑制增殖、促進凋亡作用，且與作用劑量有關，表現出明顯的劑量依賴效應。發現對於正常PBMNCS，GAA的有效抑制濃度要明顯高於對HL60細胞的抑制濃度，說明GAA對白血病細胞有選擇性殺傷作用。

惡性腫瘤的發生與腫瘤細胞增殖和分化之間的平衡失調有關，表現為增殖失控而分化受阻。許多藥物如維甲酸及某些天然成分可以促進白血病細胞向成熟分化，這也是目前治療白血病的措施之一［9］。可見，許多天然葯通過誘導白血病細胞分化來發揮抗白血病作用。在分化誘導劑作用下，HL60細胞可向成熟粒細胞分化，表現為NBT還原試驗陽性［10］。我們的結果發現，在體外培養體系中，1μmol/L與4μmol/L的GAA均能使HL60細胞形態發生改變，NBT還原試驗陽性率也明顯增高，呈時間與劑量依賴關係。這表明在誘導分化劑量下，GAA可促使HL60細胞向成熟粒系分化。通過誘導白血病細胞向成熟粒細胞分化，從而抑制其增殖，這可能也是GAA抗白血病作用的機制之一。

與傳統的化療藥物相比，棉酚的副作用就顯得簡單易於處理。過去在用於節育目的長期服用時發現主要表現為低鉀血症、個別患者睾丸生精上皮的嚴重損傷等，但發生率僅為1%左右，且臨床處理也較容易，而且相對於致命的白血病來說，這些副作用顯得微不足道。而且長期口服治療劑量的棉酚不會引起骨髓抑制，這相對其他治療白血病的化療藥物而言具有無法比擬的優勢［11-12］。更為重要的是，其代謝產物氧化棉酚同樣具有顯著的抗腫瘤作用，甚至比其原體活性還高。以上特點表明，棉酚是一種非常有前途的新型抗腫瘤藥物［13-14］。