細胞質雄性不育

由於 CMS 存在的廣泛性，CMS 植物花粉敗育具體表現也各式各樣，形態學上一般表現為花器小，花絲變短，花藥瘦小等。根據敗育發生的時期可把 CMS 分為兩類：一類為孢子體不育，可發生在花藥造胞細胞增殖至小孢子母細胞進行減數分裂的整個過程，如大豆 CMS 系 NJCMSIA 花粉敗育發生在二胞花粉期，主要表現為小孢子內生殖核與營養核消失，胞質紊亂，外壁內層及內壁停止發育，液泡增大，原生質部分解體。棕色棉 CMS 系敗育發生在小孢子期，表現為造胞細胞核仁增大，細胞質液泡化，細胞畸形，小孢子母細胞穿壁普遍、多核仁、染色體行為異常，細胞之間互相黏連。D 型胞質不育小麥的敗育亦發生在小孢子期表現為質膜破碎，細胞器解體或退化，絨氈層持續不解體。此外，胞質不育大白菜、番茄的敗育也都發生在小孢子期，且在細胞學上也都表現為質膜的解體和絨氈層的異常。可見孢子體不育在細胞學表現上具有一些共性，這為其判別提供了一定的依據；另一類為配子體不育，主要發生在小孢子進行有絲分裂形成配子的過程中。而有關這方面的研究較少，有報道表明 M-CMS 玉米為該類型。在這兩種類型的敗育中絨氈層發育異常與敗育密切相關。絨氈層由一種獨特的分泌細胞組成，它在花粉形成過程中行使著重要的功能。在花藥發育早期，絨氈層包圍著花粉囊，為發育的小孢子提供各種營養物質，在小孢子母細胞完成減數分裂后，絨氈層又能分泌胼胝質酶，分解胞囊四分孢子的胼胝質壁，釋放小孢子。它的過早解體或延遲退化都可能造成孢子發育的供養不足或使之不能正常分離，從而造成敗育。這種現象早就被觀察到，但絨氈層細胞的發育異常由何而引起？對它分子生物學的研究是否可以作為研究 CMS 分子機制的一條途徑？值得研究者思考。

植物生長發育過程涉及到各種酶、生長物質、營養物質等各類成分，它們之間的協同作用是植物正常生長發育所必需的，CMS 作為植物界中一種變異現象，它的生長發育特別是花粉的發育在某種程度上已經破壞了各物質之間的協同關係，阻礙了它們之間的交流。像雄蕊部位酶活性的變化，內源激素量的差異，營養物質的積累多少及物質代謝、能量代謝快慢等都會影響到花的育性。

2.1　CMS 與酶活性變化

同工酶分析表明在不同的材料中過氧化物酶、細胞色素氧化酶、超氧化物歧化酶、谷氨酸脫氫酶等在不育系和保持系之間存在酶活上的差異。對6種具有應用前景的 CMS 小麥和其保持系中國春小麥和華麥8號進行的谷胱甘肽過氧化物酶的活性比較表明，CMS 小麥遠低於其保持系中國春小麥和華麥8號。耿三省 等對 CMS 辣椒花藥的生化分析也表明不育系中過氧化氫酶活性明顯低於保持系。研究認為過氧化物酶能清除細胞內的活性氧，減少活性氧對細胞分子和結構的損害，不育系花粉發育異常可能與活性氧的含量高有關。

2.2　CMS 與植物激素

生長激素如赤霉素和多胺有利於雄性器官的發育，CMS 水稻不育株幼穗或花藥中赤霉素含量顯著低於相應可育株，此外，外施赤霉素能促進某些植物雄性育性表達。多胺亦是一種重要的促雄激素，在 CMS 玉米中，結合多胺的含量極低，在 CMS 水稻中也發現了類似的現象，進一步的研究表明用多胺處理 CMS 水稻、油菜等可使花粉可育度有輕度提高。而生長素、細胞分裂素、乙烯和脫落酸被普遍認為對植物的雄性發育具有抑制作用。乙烯的過度釋放是造成 CMS 的主要誘因之一，這已在多種 CMS 植物上得到了證實，而研究發現生長素對雄性發育的抑制是由於高濃度的生長素誘導了乙烯的產生。同時在大多數 CMS 植物中發現細胞分裂素含量普遍較其保持系高，有人認為不育系花藥中高含量的細胞分裂素抑制或阻止了花藥組織的抗氰呼吸，導致不育花藥呼吸系統和能量代謝系統紊亂，進而造成小孢子發育受阻和敗育。也有研究表明在一些不育株中脫落酸含量明顯低於其保持系，外施脫落酸亦可抑制某些植物雄花的發育。但具體機制仍不詳。

2.3　CMS 與營養物質

對影響 CMS 花發育的營養物質主要集中在一些可溶性蛋白質、遊離氨基酸、碳水化合物方面。蘿蔔 CMS 系與保持系的物質代謝研究表明，在不育性的花蕾中可溶性蛋白質、多糖、澱粉及遊離脯氨酸含量均低於保持系。花蕾中多糖和澱粉含量低會減緩能量代謝致使細胞產能不足，同時，使花中各部分發育受阻造成敗育。遊離脯氨酸是花發育過程中的一種重要氨基酸，它可為花發育提供重要的碳源和氮源，並且可直接用於蛋白質的合成。因此，遊離脯氨酸含量低可直接影響發育過程中一些酶和結構物質的合成。

對 CMS 植物生理生化方面的研究國內學者做了大量工作，但還不系統，不能從深層次解釋一些問題，如果把新近出現的蛋白質組學的有關概念引進來，相信還有很大的研究空間。

由於 CMS 系和保持系具有相同的核背景，且 CMS 為母系遺傳，因此研究者普遍認為導致 CMS 的主要因素可能與植物胞質中的遺傳系統——線粒體、葉綠體或線粒體的類質粒有關。但由於技術方法等各方面的原因阻礙了人們對 CMS 本質的認識。直到進入20世紀80年代，隨著分子生物學的發展及細胞器 DNA 分離技術的日臻完善，才使得對 CMS 分子機制的研究有了長足的發展。

3.1　CMS 與線粒體基因組

根據目前的研究，線粒體基因組的變異重組與 CMS 的關係最為密切。通過對不同材料的 CMS 系和保持系線粒體 DNA 的 RFLP、RAPD、AFLP 等多態性分析表明，CMS 系和保持系在線粒體基因組結構上具有顯著差異。這可能與植物線粒體基因組自身的特點有關。與動物和真菌的線粒體基因組比起來，植物線粒體基因組大(200～2500 kb)而且複雜，內含有許多同向或反向重複序列，這些序列的存在使得線粒體基因組可與核基因組、葉綠體基因組或自身之間發生高頻重組，重組可能引起結構和功能的改變，這極可能是導致 CMS 的主要原因。通過比較物理圖譜法、轉座子標記法、互補實驗等獲得了幾個與 CMS 相關的線粒體基因區段。如 CMS 高梁的 orfl07，T-CMS 玉米的 T-urf13 區，Polima 型 CMS 油菜的 orf224 區，CMS 水稻的 orf79 區， CMS 矮牽牛的 pcf 區，CMS 菜豆的 pvs 區，Ogura 型 CMS 蘿蔔的 orf138 等。分析發現這些相關區段一般都與線粒體所編碼的功能基因緊密連鎖並與其共轉錄。對 CMS 相關線粒體基因的研究，特別是對這些基因的轉錄、轉錄后調控、翻譯及翻譯后調控的研究，是當前 CMS 分子機制研究的熱點。同時研究也發現線粒體 RNA 的編輯可能與 CMS 的發生密切相關。

此外，在一些植物的線粒體上還存在一種環狀或線狀的小 DNA 分子，被稱之為類質粒 DNA 分子，其也具有自主複製的能力，一般在其末端都含有反向重複序列，且與核基因組序列有同源區，在 CMS 系和保持系之間存在差異。Yamaguchi 等首先在 BT 型水稻不育系發現類質粒 DNA 的存在，其大小分別為1.5 kb和1.2 kb，而在保持系中未發現。Mignouna 等在野敗型珍汕 97A 水稻中也發現一個2.1 kb的類質粒 DNA。此外，在玉米、高梁、甜菜等 CMS 系中也發現了類質粒的存在。但目前只是從一些現象上推測類質粒 DNA 可能與 CMS 相關，還缺少具有說服力的實驗依據。

3.2　CMS 與葉綠體基因組

CMS 與葉綠體的關係目前還存在很大的爭議。相對於植物線粒體而言，葉綠體基因組較為保守也較小(120～160 kb)，因此對它的認識要比對線粒體深入的多。研究發現植物葉綠體一般分為4個區：兩個反向重複區，大單拷貝區和小單拷貝區。目前已有多種植物葉綠體的物理圖譜被構建。對高粱的 CMS 系及相應保持系的葉綠體 ndhD 基因的酶切分析表明，CMS 系與相應保持系之間存在明顯的差異，且在後續的研究中克隆到了保持系所特有的兩個葉綠體基因片段 ps1A1 和 ps1A2。但 Levings 等對玉米，Kadowaki 等對水稻的葉綠體 DNA 的酶切電泳未發現不育系和保持系之間存在差異。對細香蔥、煙草等的研究也發現葉綠體 DNA 與 CMS 無關。因此，葉綠體基因組是否與 CMS 有關還有待進一步研究。

3.3　CMS 與核基因組

對胞質遺傳物質的研究無疑加深了人們對 CMS 現象分子機制的認識，但是 CMS 是一種核質互作的結果，因此核基因組在 CMS 發生過程的作用是不容忽視的。研究表明在核基因組中可能存在育性恢復(restorer of fertility，Rf)基因。在 Rf 基因存在下，與 CMS 相關的線粒體等胞質 DNA 的突變表型可得到有效的校正，育性得到恢復。

3.3.1　Rf 基因對 CMS 相關基因的作用　Rf基因可對 CMS 基因轉錄本的穩定性、轉錄后加工、翻譯及翻譯后加工、甚而基因的結構產生影響。對 CMS 小麥(T.timopheevi)的研究表明，CMS 相關片段 orf256 與線粒體基因 coxI 形成嵌合基因 orf256/coxI共轉錄，在 CMS 系中轉錄起始點位於 orf256 的5"非翻譯區，orf256 完整轉錄能編碼 M為7000的蛋白質，其結合於線粒體膜上，直接影響花粉育性。而通過雜交引入 Rf 基因后，嵌合基因的轉錄本變小，且起始點位於 orf256 編碼區內不能翻譯形成蛋白質。細胞質來源於 1s1112c 的 CMS 高梁在其線粒體上的不育相關片段 orf107 編碼 M為11800的蛋白質在線粒體內大量積累，而在雜交引入 Rf 基因后 orfl07 的轉錄本被加工成小片段，從而無全長轉錄本產物的存在，育性得以恢復。Rf 基因對 CMS 相關基因轉錄后加工的影響在胞質源於 Chinsurah boroII的水稻中找到了例證。Chinsurah boroII CMS 水稻線粒體中有兩類 atp6 基因，N-atp6 與正常胞質的相同，S-atp6 為不育系所特有，二者編碼區相同只是在3"非編碼區有差異。在不育系中 S-atp6 轉錄本為2.0 kb，不能被進一步加工形成1.5 kb的正常轉錄本，編碼形成不正常的 ATP6 蛋白，抑制或競爭正常的 ATP6 蛋白使線粒體功能受損。而在引入Rf基因后 S-atp6 2.0 kb的轉錄本被有效加工，形成正常轉錄本。此外在 pol 型 CMS 油菜、S-CMS 玉米、CMS 細香蔥及 CMS 芥菜等中都發現 Rf 基因對 CMS 相關基因轉錄及轉錄后加工的影響。因此認為 Rf 基因對 CMS 基因轉錄水平的影響是 Rf 基因常見的一種作用方式。在對 CMS 菜豆的研究發現，其育性恢復可通過核基因上的兩個恢復基因 Rf1、Rf2 通過不同的機制來完成。Rf1 可直接取消與不育對應的3.7 kb的 pvs 片段。從而永久性的恢復育性。而Rf2 通過在翻譯后水平影響線粒體不育片段 pvs 編碼多肽 ORF239 的穩定性，對育性進行調節。Ogura 型胞質不育蘿蔔的 Rf 基因對線粒體嵌合讀碼框 orf138 的作用方式也是如此。總之， Rf 基因對 CMS 的影響是確實存在的，它可以對 CMS 相關基因在各個層次上進行調控。但 Rf 基因的分子本質到底如何，這顯然更吸引研究者的興趣。

3.3.2　Rf 基因的克隆　很長一段時間內，由於在技術及方法等方面的局限，只有 T-CMS 玉米的恢復基因 Rf2 得到克隆，並確認其為核編碼的乙醛脫氫酶基因。但隨著研究的深入，最近有人也對其是否是恢復基因產生了置疑，Touzet 認為 T-CMS 玉米的 Rf 基因是育性基因，而不是育性恢復基因。拋開概念上的爭議，當前這方面的研究已取得了很大的進展，特別是在人類基因組計劃及其他模式生物基因組計劃的帶動下，大規模測序及後期的數據處理已不是那麼的困難。研究者已不再局限於針對育性恢復基因的遺傳定位及圖譜的構建，而是在此基礎上進行基因的克隆。BT-CMS 水稻的育性恢復基因 Rf-1 被限定在一個只有22 kb大小的區域上，Kosena 型 CMS 蘿蔔的育性恢復基因限定在一個43 kb的區域上，CMS 矮牽牛的育性恢復基因與一個長度為37.5 kb的 BIBAC 克隆共分離。並發現 BT-CMS 水稻 Rf-1 基因所在的區域能編碼含 PPR(pentatricopeptide repeat)模體的蛋白質，該模體樣蛋白質在 Ogura 型 CMS 蘿蔔的育性恢復基因 Rf0 及 CMS 矮牽牛的 Rf 基因中也都存在。這一發現似乎預示著一些胞質不育植物的 Rf 基因可能存在一些共性，隨著研究的深入，這方面可能會取得大的進展，值得研究者注意。

3.4　基因工程創造 CMS 系

Mariani 等早在20世紀90年代初就利用轉基因的方法獲得 CMS 株，其利用煙草花藥絨氈層專一性表達的 TA29 基因的啟動子與解澱粉芽孢桿菌的核糖核酸水解酶(barnase)基因構成嵌合基因，導入植物體內，通過 TA29 基因啟動子的專一性使 barmase 基因特異的在花藥絨氈層組織細胞內得以表達，降解絨氈層細胞內的 RNA，從而阻礙花藥絨氈層的發育，使花粉敗育。這是當前採用轉基因獲得 CMS 系的主要手段。此外，利用反義技術等方法構建 CMS 系也有報道，但效果並不理想。這方面的突破還有待於對 CMS 分子機制的進一步認識。

CMS 是植物在發育過程中核質互作的一種結果，其發生機制可能與其體內3個遺傳系統——線粒體、葉綠體、核基因都有關。它們有相對獨立的一面，但更多的可能是它們之間相互的影響、相互聯繫、相互滲透。這就決定了 CMS 發生的複雜性。當前大量 CMS 相關線粒體基因的發現，無疑加深了對這一現象分子機制的認識，但這些嵌合基因是如何產生的，在這過程中葉綠體基因及核基因發揮了何種作用，還有太多的未知。因此要想加深對 CMS 機制的認識，一方面應該採用新的技術、新的思路克隆出更多的 CMS 相關基因及恢復基因，並對這些基因的轉錄、轉錄后加工等的機制及所編碼的產物進行深入研究。另一方面應充分利用當前所飛速發展起來的生物信息學，利用其對海量數據的處理能力，使之與實驗科學有機結合，加深對這些基因及其產物之間相互關係的研究。只有這樣才能為揭示植物 CMS 之謎提供更多更有力的證據，才能為利用分子手段獲得 CMS 系提供更有力的指導，為雜種優勢的利用創造更廣闊的空間。