微生物生長曲線

微生物在適宜的環境條件下，不斷地吸收營養物質，並按照自己的代謝方式進行代謝活動，如果同化作用大於異化作用，則細胞質的量不斷增加，體積得以加大，於是表現為生長。簡單地說，生長就是有機體的細胞組分與結構在量方面的增加。

單細胞微生物如細菌，生長往往伴隨著細胞數目的增加。當細胞增長到一定程度時，就以二分裂方式，形成兩個基本相似的子細胞，子細胞又重複以上過程。在單細胞微生物中，由於細胞分裂而引起的個體數目的增加，稱為繁殖。在一般情況下，當環境條件適合，生長與繁殖始終是交替進行的。從生長到繁殖是一個由質變到量變的過程，這個過程就是發育。

微生物處於一定的物理、化學條件下，生長發育正常，繁殖速率也高；如果某一或某些環境條件發生改變，並超出了生物可以適應的範圍時，就會對機體產生抑制乃至殺滅作用。

二、細菌純培養的群體生長規律

大多數細菌的繁殖速度都很快，大腸桿菌在適宜條件下，每20分鐘左右便可分裂一次，如果始終保持這樣的繁殖速度，一個細菌在48小時內，其子代群體將達到無法想象的數量。然而，實際情況並非如此。

將少量單細胞純培養接種到一恆定容積的新鮮液體培養基中，在適宜的條件下培養，定時取樣測定其細菌含量，可以看到以下現象：開始有一短暫時間，細菌數量並不增加，隨之細菌數目增加很快，既而細菌數又趨穩定，最後逐漸下降。如果以培養時間為橫坐標，以細菌數目的對數或生長速度為縱坐標作圖，可以得到一條曲線，稱為繁殖曲線，通常又稱為生長曲線。生長曲線代表了細菌在新的適宜的環境中生長繁殖直至衰老死亡全過程的動態變化。

生長量測定法

體積測量法：又稱測菌絲濃度法。

通過測定一定體積培養液中所含菌絲的量來反映微生物的生長狀況。方法是，取一定量的待測培養液（如10毫升）放在有刻度的離心管中，設定一定的離心時間（如5分鐘）和轉速（如5000 rpm），離心后，倒出上清夜，測出上清夜體積為v，則菌絲濃度為（10-v）/10。菌絲濃度測定法是大規模工業發酵生產上微生物生長的一個重要監測指標。這種方法比較粗放，簡便，快速，但需要設定一致的處理條件，否則偏差很大，由於離心沉澱物中夾雜有一些固體營養物，結果會有一定偏差。

稱乾重法：

可用離心或過濾法測定。一般乾重為濕重的10-20%。在離心法中，將一定體積待測培養液倒入離心管中，設定一定的離心時間和轉速，進行離心，並用清水離心洗滌1-5次，進行乾燥。乾燥可用烘箱在105 ℃或100℃下烘乾，或採用紅外線烘乾，也可在80℃或40℃下真空乾燥，乾燥后稱重。如用過濾法，絲狀真菌可用濾紙過濾，細菌可用醋酸纖維膜等濾膜過濾，過濾後用少量水洗滌，在40C下進行真空乾燥。稱乾重發法較為繁瑣，通常獲取的微生物產品為菌體時，常採用這種方法，如活性乾酵母（activity dry yeast, ADY）,一些以微生物菌體為活性物質的飼料和肥料。

比濁法：

微生物的生長引起培養物混濁度的增高。通過紫外分光光度計測定一定波長下的吸光值，判斷微生物的生長狀況。對某一培養物內的菌體生長作定時跟蹤時，可採用一種特製的有側臂的三角燒瓶。將側臂插入光電比色計的比色座孔中，即可隨時測定其生長情況，而不必取菌液。該法主要用於發酵工業菌體生長監測。如我所使用UNICO公司的紫外-可見分光光度計，在波長600nm 處用比色管定時測定發酵液的吸光光度值OD600，以此監控E.Coli的生長及誘導時間。

菌絲長度測量法：

對於絲狀真菌和一些放線菌，可以在培養基上測定一定時間內菌絲生長的長度，或是利用一隻一端開口並帶有刻度的細玻璃管，倒入合適的培養基，卧放，在開口的一端接種微生物，一段時間後記錄其菌絲生長長度，藉此衡量絲狀微生物的生長。

微生物計數法

血球計數板法:

血球計數板是一種有特別結構刻度和厚度的厚玻璃片，玻片上有四條溝和兩條嵴，中央有一短橫溝和兩個平台，兩嵴的表比兩平台的表面高0.1 mm，每個平台上刻有不同規格的格網，中央0.1 mm面積上刻有400個小方格。通過油鏡觀察，統計一定大格內微生物的數量，即可算出1毫升菌液中所含的菌體數。這種方法簡便，直觀，快捷，但只適宜於單細胞狀態的微生物或絲狀微生物所產生的孢子進行計數，並且所得結果是包括死細胞在內的總菌數。

染色計數法：

為了彌補一些微生物在油鏡下不易觀察計數，而直接用血球計數板法又無法區分死細胞和活細胞的不足，人們發明了染色計數法。藉助不同的染料對菌體進行適當的染色，可以更方便的在顯微鏡下進行活菌計數。如酵母活細胞計數可用美藍染色液，染色后在顯微鏡下觀察，活細胞為無色，而死細胞為藍色。

比例計數法：

將已知顆粒（如黴菌孢子或紅細胞）濃度的液體與一待測細胞濃度的菌液按一定比例均勻混合，在顯微鏡視野中數出各自的數目，即可得未知菌液的細胞濃度。這種計數方法比較粗放。並且需要配製已知顆粒濃度的懸液做標準。

液體稀釋法：

對未知菌樣做連續十倍系列稀釋，根據估計數，從最適宜的三個連續的10倍稀釋液中各取5毫升試樣，接種1毫升到3組共15隻裝培養液的試管中，經培養後記錄每個稀釋度出現生長的試管數，然後查最大或然數表MPN（most probably number）得出菌樣的含菌數，根據樣品稀釋倍數計算出活菌含量。該法常用於食品中微生物的檢測，例如飲用水和牛奶的微生物限量檢查。

平板菌落計數法：

這是一種最常用的活菌計數法。將待測菌液進行梯度稀釋，取一定體積的稀釋菌液與合適的固體培養基在凝固前均勻混合，或將菌液塗佈於已凝固的固體培養基平板上。保溫培養后，用平板上出現的菌落數乘以菌液稀釋度，即可算出原菌液的含菌數。一般以直徑9cm的平板上出現50-500個菌落為宜。但方法比較麻煩，操作者需有熟練的技術。平板菌落計數法不僅可以得出菌液中活菌的含菌數，而且同時將菌液中的細菌進行了一次分離培養，獲得了單克隆。

試劑紙法：

在平板計數法的基礎上，發展了小型商品化產品以供快速計數用。形式有小型厚濾紙片，瓊脂片等。在濾紙和瓊脂片中吸有合適的培養基，其中加入活性指示劑2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC，無色）待蘸取測試菌液後置密封包裝袋中培養。短期培養后在濾紙上出現一定密度的玫瑰色微小菌落與標準紙色板上圖譜比較即可估算出樣品的含菌量。試劑紙法計數快捷準確，相比而言避免了平板計數法的人為操作誤差。

膜過濾法：

用特殊的濾膜過濾一定體積的含菌樣品，經丫叮橙染色，在紫外顯微鏡下觀察細胞的熒光，活細胞會發橙色熒光，而死細胞則發綠色熒光。

生理指標法：

微生物的生長伴隨著一系列生理指標發生變化，例如酸鹼度，發酵液中的含氮量，含糖量，產氣量等，與生長量相平行的生理指標很多，它們可作為生長測定的相對值。

測定含氮量：

大多數細菌的含氮量為乾重的12.5%，酵母為7.5%，黴菌為6.0%。根據含氮量×6.25，即可測定粗蛋白的含量。含氮量的測定方法有很多，如用硫酸，過氯酸，碘酸，磷酸等消化法和Dumas測N2氣法。Dumas測N2氣法是將樣品與CuO混合，在CO2氣流中加熱后產生氮氣，收集在呼吸機中，用KOH吸去CO2后即可測出N2的量。

測定含碳量：

將少量（乾重0.2-2.0 mg）生物材料混入1毫升水或無機緩衝液中，用2毫升2%的K2Cr2O7溶液在100 C下加熱30分鐘后冷卻。加水稀釋至5毫升，在580nm的波長下讀取吸光光度值，即可推算出生長量。需用試劑做空白對照，用標準樣品做標準曲線。

還原糖測定法：

還原糖通常是指單糖或寡糖，可以被微生物直接利用，通過還原糖的測定可間接反映微生物的生長狀況，常用於大規模工業發酵生產上微生物生長的常規監測。方法是，離心發酵液，取上清液，加入斐林試劑，沸水浴煮沸3分鐘，取出加少許鹽酸酸化，加入Na2S2O3臨近終點時加入澱粉溶液，繼續加Na2S2O3至終點，查表讀出還原糖的含量。

氨基氮的測定：

方法是，離心發酵液，取上清液，加入甲基紅和鹽酸作指示劑，加入0.02N的NaOH調色至顏色剛剛褪去，加入底物18%的中性甲醛，反應數刻，加入0.02N的使之變色，根據NaOH的用量折算出氨基氮的含量。根據培養液中氨基氮的含量，可間接反映微生物的生長狀況。

其他生理物質的測定：

P，DNA，RNA，ATP，NAM（乙醯胞壁酸）等含量以及產酸，產氣，產CO2（用標記葡萄糖做基質），耗氧，黏度，產熱等指標，都可用於生長量的測定。也可以根據反應前後的基質濃度變化，最終產氣量，微生物活性三方面的測定反映微生物的生長。如我所在BMP-2的發酵生產上，隨時監測溶氧量的變化和酸鹼度的變化，判斷細菌的長勢。

商業化快速微生物檢測法：

微生物的檢測，其發展方向是快速，準確，簡便，自動化，當前很多生物製品公司利用傳統微生物檢測原理，結合不同的檢測方法，設計了形式各異的微生物檢測儀器設備，正逐步廣泛應用於醫學微生物檢測和科學研究領域。例如：

1、抗干擾培養基和微生物數量快速檢測技術結合解決了傳統微生物檢測手段不能解決的難題，為建立一套完整的抗干擾微生物檢測系統奠定了堅實的基礎。中科院廣州分院合作產業處提供的抗干擾微生物培養基，新型生化鑒定管，微生物計數卡，環境質量檢測試劑盒等，可方便的用於多項檢測。

2、BACTOMETER 全自動各類總菌數及快速細菌檢測系統可以數小時內獲得監測結果，樣本顏色及光學特徵都不影響讀數，對酵母和黴菌檢測同樣高度敏感原理是利用電阻抗法（IMPEDANCE TECHNOLOGY）將待測樣本與培養基置於反應試劑盒內，底部有一對不鏽鋼電極，測定因微生物生長而產生阻抗改變。如微生物生長時可將培養基中的大分子營養物經代謝轉變為活躍小分子，電阻抗法可測試這種微弱變化，從而比傳統平板法更快速監測微生物的存在及數量。測定項目包括總生菌數，酵母菌，大腸桿菌群，黴菌，乳酸菌，嗜熱菌，革蘭氏陰性菌，金黃色葡萄球菌等。

典型的微生物生長曲線包括四個時期：遲緩期、對數期、穩定期、衰亡期。

特點：生長速率常數為零、菌體粗大、RNA含量增加、代謝活力強、對不良環境的抵抗能力下降。

成因：微生物剛剛接種到培養基之上，其代謝系統需要適應新的環境，同時要合成酶、輔酶、其他代謝中間代謝產物等，所以此時期的細胞數目沒有增加。

特點：生長速率最快、代謝旺盛、酶系活躍、活細菌數和總細菌數大致接近、細胞的化學組成形態理化性質基本一致。

成因：經過調整期的準備，為此時期的微生物生長提供了足夠的物質基礎，同時外界環境也是最佳狀態。

特點：活細菌數保持相對穩定、總細菌數達到最高水平、細胞代謝產物積累達到最高峰、是生產的收穫期、芽孢桿菌開始形成芽孢。

成因：營養的消耗使營養物比例失調、有害代謝產物積累、PH值EH值等理化條件不適宜。

特點：細菌死亡速度大於新生成的速度、整個群體出現負增長、細胞開始畸形、細胞死亡出現自溶現象。

成因：主要是外界環境對繼續生長越來越不利、細胞的分解代謝大於合成代謝、繼而導致大量細菌死亡。

任何生物都有出生、發育、繁殖、衰老和死亡的過程。微生物也不例外。不過，微生物的生長規律和大生物有些不同，大生物通常是以一個個體為對象，而微生物的生長通常指細胞數目的增加。如果把單細胞的微生物接種到體積一定的液體營養液中，在適宜的培養條件下進行培養，這些單細胞微生物就會不斷增殖，細胞數目會不斷增加，如果把這種增加情況畫一個對數曲線，就呈現出一定的規律，叫做單細胞微生物的生長曲線。其縱坐標為每毫升培養液中微生物細胞數目的對數，橫坐標為培養時間。生長曲線代表細菌在一個新的適宜的環境中生長繁殖以至衰老死亡的全部過程的動態。

在細菌的對數生長期，有幾個重要的指標用來反映微生物生長的情況。分裂的次數：以n表示，即一個單細胞微生物一分為二的次數。生長速率常數：以R表示，指每小時細胞分裂的次數。代時：以G表示，指細胞每分裂一次所需要的時間。下表列出了一些微生物的代時。

一些細菌的代時

1、微生物曲線出現的前提條件

（1）只能用同一種細菌的子細胞群體的變化規律表達微生物的生長，若接種多種細菌則會發生種間競爭而不能測定一種微生物的生長規律。

（2）用液體培養基才能更方便地通過樣品推測細菌總數。

（3）培養基地容積恆定才能反映出微生物生長規律與環境的關係

（4）在接種時要保證一定的接種量，才能縮短調整期。

2、增大接種量可以縮短調整期的原因

調整期的長短與菌種、培養條件等因素有關，增大接種量可以縮短調整期，實際上利用的生物的一種群體效應，也就是通過種內的相互關係(如種內互助),使之更快地適應新環境，從而縮短調整期。像引進一種動物到新環境一樣，如果引入少數個別的動物，那麼就需要更長的適應時間甚至有可能無法生存；但如果引進的是一個種群，那麼就會大大縮短適應的時間。另外，生物的生命活動也會影響環境，如果生物的數量多些，對環境的影響更大些，從而使環境變得更適合生物的生存，從而縮短調整期

. 3、連續培養：

過程及實質：在一個流動裝置中，以定速度不斷地添加新的培養基，同時以同速度不斷放出老的培養基，以保證微生物對營養物質的需要，並排出部分有害代謝產物，使微生物保持較長時間的高速生長。實質是人為延長微生物生長的穩定期。

優點：縮短了培養周期，提高了設備利用率，便於自動化管理。

根據微生物的生長曲線可以明確微生物的生長規律，對生產實踐具有重大的指導意義。故根據對數期的生長規律可以得到培養菌種時縮短工期的方法：接種對數期的菌種，採用最適菌齡，加大接種量，用與培養菌種相同組成的培養基。有如，根據穩定期的生長規律，可知穩定期是產物的最佳收穫期，也是最佳測定期，通過對穩定期到來原因的研究還促進了連續培養原理的提出和工藝技術的創建。