DNA指紋圖譜

1.1 高變異DNA 序列的發現

1980 年，Wyman 和 White 在進行人體DNA 基因文庫的研究中，篩選到一個隨機DNA 片段，以其為探針進行RFLPs 分析，檢測到8 個等位基因，平均雜合率超過75%，因此推測該位點的多態性來源於DNA 重排而非鹼基突變，這是人類基因組中發現的第一個高變區（hypervariable regions，簡稱HVRs）。此後，人們在人類基因組中又陸續發現了其他一些高變區，如α-珠蛋白基因（Higgs 等 1981，1986）、胰島素基因（Bell 等 1982）、脂蛋白基因（Knott等 1986）、D-Ha-ras 癌基因（Capon 等 1983）、Zata-珠蛋白基因（Goodbourm 等 1983）等基因的側翼及肌紅蛋白基因（Weller 等1984）的第一個內含子區域，都含有這種HVRs。這些高變區的共同特點為：都是由一短序列（即重複單位）首尾相連、多次重複而成，其多態性來源於重複單位的重複次數不同。同一高變區的這些重複單位還具有高度的保守性，但因重複單位的重複數目不同，形成了眾多的等位基因。這些高變區後來被叫做小衛星（minisatellite）（Jeffreys 等 1985a），有的人又稱其為可變數目串聯重複序列（variable number of tandemrepeat，簡稱VNTR）（Nakmura 等1987）。在小衛星DNA 內，重複單位數目的高度變異是由於不等交換所造成的，換言之，即在有絲分裂時的姊妹染色單體（sister chromatids）或減數分裂時的同源染色體間互換所致。有時候，發現DNA 鏈架突變的發生頻率高於點突變，其頻率為每世代每千個核苷酸對在10－ 5～10－ 2。雖然不等互換導致重複單位數目增加或減少，但不同重複的形成卻是由於點突變造成的。此外，基因轉換（gene conversion）與重組似乎在同源性的維持上扮演著重要的角色。在DNA 複製期間的滑動複製（slippage）是重複單位內簡單序列（1～4 個核苷酸對）演化的機制（Wolf 等 1989）。故有絲分裂或減數分裂時不等互換、基因轉換及滑動複製，均足以導致重複單位間同源性的維持及重複單位數目的變化。大多數重複序列單位共有一個約 10～15 個核苷酸對的核心序列（core sequence），此核心序列高度地保留於相關的小衛星DNA 家族中，它是重組信號，可能是真核生物DNA 重組交換的熱點，可促進小衛星DNA 的不等交換（Jeffreys 等 1985a；Wyman 等 1990）。核心序列是重複單位間序列相似的基礎。在小衛星DNA 區域內，同源染色體可能有不同數目的重複單位，利用限制性內切酶可產生DNA 指紋。由此可見，串聯重複序列的高度變異性與其特殊的結構密切相關。然而，基因組中此類串聯重複序列的真實生物學功能至今仍不清楚。

1.2 DNA 指紋圖譜的發現

1985 年，英國來斯特大學遺傳系的Jeffreys（1985a）及其同事在《Nature》雜誌上報道了他們對人體基因組高變區的突破性研究。他們用肌紅蛋白基因第一個內含子中的串聯重複序列（重複單位長33bp）作探針，從人的基因文庫中篩選出8 個含有串聯重複序列（小衛星）的重組克隆。經序列分析，發現每個克隆都含有一個長0.2～2.0kb、由重複單位重複3～29 次組成的小衛星DNA。儘管這8 個小衛星的重複單位的長度（16～64bp）和序列不完全相同，但都含有一段相同的核心序列，其鹼基順序為 GGGCAGGAA。他們用 16bp 重複單位（主要為核心序列）重複29 次而成的小衛星33.15做探針，與人基因組酶切片段進行Southern 雜交，在低嚴謹條件下雜交產生由10 多條帶組成的雜交圖譜，不同個體雜交圖譜上帶的位置是千差萬別的。隨後他們用另外一個小衛星探針33.6 進行測試，獲得了類似的圖譜。這種雜交圖譜就像人的指紋一樣因人而異，因而Jeffreys（1985b）等人稱之為DNA 指紋圖譜（DNA finger print），又名遺傳指紋圖譜（genetic finger print）。產生DNA 指紋圖譜的過程就叫做DNA 指紋分析（DNA finger printing）。

1.3 DNA 指紋圖譜的特點

DNA 指紋圖譜具有以下3 個基本特點：

（1）多位點性：基因組中存在著上千個小衛星位點，某些位點的小衛星重複單位含有相同或相似的核心序列。在一定的雜交條件下，一個小衛星探針可以同時與十幾個甚至幾十個小衛星位點上的等位基因雜交。一般來說，一個DNA 指紋探針（又稱多位點探針）產生的某個個體DNA 指紋圖譜由10～20 多條肉眼可分辨的圖帶組成。由於大部分雜合小衛星位點，僅一個等位基因出現在圖譜的可分辨區內（兩個等位基因由於重複單位、重複次數不同，在長度上差異很大），因而每條可分辨圖帶代表一個位點。很多的研究表明，個體DNA 指紋圖譜中的帶很少成對連鎖遺傳，所代表的位點廣泛地分佈於整個基因組中（Burke 等1987；Hiu 等1985）。一個傳統的RFLPs 探針一次只能檢測一個特異性位點的變異性，所產生的圖譜一般由l～2 條帶組成，僅代表一個位點。因此兩者比較而言，DNA指紋圖譜更能全面地反映基因組的變異性。

（2）高變異性：DNA 指紋圖譜的變異性由兩個因素所決定，一是可分辨的圖帶數，二是每條帶在群體中出現的頻率。DNA 指紋圖譜反映的是基因組中高變區，由多個位點上的等位基因所組成的圖譜必然具有很高的變異性。DNA 指紋圖譜在個體或群體之間表現出高度的變異性，即不同的個體或群體有不同的DNA 指紋圖譜。一般選用任何一種識別4 個鹼基的限制性內切酶，這種變異性就能表現出來。Jeffreys 等（1985b）對人的DNA 指紋圖譜的研究表明，DNA 指紋圖譜中的大部分譜帶都以雜合狀態存在，平均雜合率大於70%，某些大片段的雜合率甚至高達100%。用探針33.15 進行DNA 指紋分析時，發現兩個無血緣關係的個體具有相同DNA 指紋圖譜的概率僅為3× 10－11；而將探針33.15 和33.6 產生的DNA 指紋圖譜綜合起來分析時，則這種概率為5×10－19，可見DNA 指紋圖譜具有高度的個體特異性。但是，同卵雙胞胎的DNA 指紋圖譜是相同的，因其有完全相同的基因組（Hiu 等1985）。值得注意的是，由於瓊脂糖凝膠電泳解析度的限制，DNA 指紋圖譜大片段區域的變異性往往很高，而小片段區域的變異性則很低，因此在實際操作時往往將小於 2kb 的小片段跑出膠外或不作統計。

（3）簡單而穩定的遺傳性：Jeffreys 等（1985a）通過家系分析表明，DNA 指紋圖譜中的譜帶能夠穩定地從上一代遺傳給下一代。子代DNA 指紋圖譜中的每一條帶都能在其雙親之一的圖帶中找到，而產生新帶的概率（由基因突變產生）僅在0.001～0.004 之間。DNA 指紋圖譜中的雜合帶遵守盂德爾遺傳規律，雙親的各圖帶平均傳遞給50%的子代。DNA 指紋圖譜還具有體細胞穩定性，即用同一個體的不同組織如血液、肌肉、毛髮、精液等的DNA 做出的DNA 指紋圖譜是一致的（Gill 等1985），但組織細胞的病變或組織特異性鹼基甲基化可導致個別圖帶的不同。

1.4 DNA 指紋圖譜的應用

由於DNA 指紋圖譜具有多位點性、高變異性、簡單而穩定的遺傳性，因而自其誕生就引起了人們的重視，表現出巨大的實用價值。DNA 指紋圖譜的高變異性和體細胞穩定性可用於鑒定個體，這對法醫學上鑒別犯罪分子和確定個體間的血緣關係極有價值（Jeffreys 等1985b，1985c）。如我國公安部利用DNA 指紋圖譜已偵破數百例疑難案件。其簡單的遺傳性可用來鑒定親子關係，其多位點性可用來檢測目標基因組的病變及治療等過程中的改變情況。1987 年Burke、Jeffreys 和Wetton 等報道了用人源核心序列小衛星探針33.6 和33.15 檢測到哺乳動物到鳥類、爬行動物、兩棲動物、魚、昆蟲等的高變異小衛星，產生具有個體特異性或類群特異性的DNA 指紋圖譜。1988 年，Dallas 用人源小衛星探針33.6 獲得了水稻的DNA 指紋圖譜。隨後，美國華盛頓大學生物系Nybom 等人對果樹植物的DNA 指紋圖譜進行了大量的研究。1989年，Braithwaite 和Manners 首次將人源小衛星探針33.6 和33.15 用作真菌的DNA 指紋分析獲得了成功，從而進一步證明DNA 指紋技術具有廣泛的適用性。這些發現使DNA 指紋圖譜成為研究動植物群體遺傳結構、生態與進化、分類等很有價值的遺傳標記。

1.5 DNA 指紋圖譜的研究進展

1.5.1 DNA 指紋分析的探針

兩個最早的DNA 指紋探針是1985 年Jeffreys 及其同事所發現的人源小衛星探針33.6 和33.15（Jeffreys 等 1985a）。1987 年，Vassart 等發現無外源DNA 片段的細菌噬菌體M13 本身就能夠作為一個DNA 指紋探針檢測出人和動物基因組中的高變異小衛星DNA，其有效序列是蛋白質 Ⅲ 編碼區內的兩個小衛星序列。從此，M13 便也成為各種動植物重要的DNA 指紋探針（Gatei 等 1991；Kuhnlein 等 1989）。另一個在人和動物上廣泛應用的 DNA 指紋探針是3´HVR（Jarman 等 1986），它來源於人α-珠蛋白的3´端的一個高度重複區。以上4 個小衛星探針的重複單位的序列結構如下所示：

33.6（AGGGCTGGAGG）3

33.15（AGAGGTGGGCAGGTGG）

M13（GAGGGTGGNGGNTCT）

3´HVR（GNGGGGNACAG）

從迄今已有的報道來看，在DNA 指紋分析中用得最多的多位點小衛星探針為33.6、33.15、M13 及3´HVR。此外，人們還從某些動物的基因組中分離克隆了一些小衛星DNA 用作DNA 指紋探針。如牛的小衛星探針PSRC-7（ Plante 等 1991）和豬的小衛星探針pS35（Coppieters 等 1990）。人工合成的簡單重複序列微衛星探針也廣泛地用於DNA 指紋分析，如（GTG）5 、（TG）8、（AT）8、（TCC）5 、（GACA）4。從基因組中分離克隆的微衛星DNA 指紋探針有PGB725 （牛）（Kashi 等 1990）和 R18.1 （豬）（Haberfield 等 1991）。孟安明（1993）發現，任何一個動物個體的基因組總DNA 可標記作為DNA 指紋探針（基因組探針），在該個體所屬物種及其他相關物種上產生具有個體特異性的雜交圖譜。以基因組探針進行DNA 指紋分析不需通過複雜的操作來獲得探針DNA，有利於DNA 指紋技術的推廣。

1.5.2 DNA 指紋圖譜的重要發展

DNA 指紋圖譜的重要發展是微衛星DNA 指紋圖譜。微衛星（microsatellite）是由2～6 個核苷酸組成的重複單位串聯排列而成的DNA 序列。據估計，在真核生物基因組每10kb 的DNA 序列中至少有一個微衛星（Tautz 1989），如人體基因組中僅二核苷酸串聯重複的微衛星就多達 50 000～100 000 個。大多數微衛星的長度小於 200bp，但也有更長的微衛星。微衛星不同於小衛星，它們廣泛分佈於很多結構基因的內含子、基因間隔區甚至調控序列中（Tautz 等 1984；Weising 1989；Ishii 等 1985）。早在1974 年，Skinner 等就在寄居蟹（hermit crab）基因組中發現了微衛星DNA，當時叫做簡單串聯重複序列（simple tandem repeat）。Singh 等人在1980 年發現蛇的W 性染色體上也存在著這種序列，它是由GATA/GACA 重複單位組成的。以後的研究表明，在真核生物甚至原核生物的基因組中都普遍存在這種序列（Jones 等 1981；Tautz 等 1986）。直到1986 年，Ali 等人首次用合成的GATA/GACA 寡聚核苷酸作探針用於人的DNA 指紋分析，成功地開創了利用微衛星DNA 探針進行DNA 指紋分析這一新的領域。微衛星探針易於合成，可直接與固定在干膠中的DNA 片段雜交，所檢測的位點普遍具有高度的變異性。1988 年，Schafer 等人進一步發展了這門技術，使寡聚核苷酸（微衛星）分析技術又一次得到了完善。迄今為止，合成的各種寡聚核苷酸（微衛星）已成功地應用於人和近百種動植物的DNA 指紋分析（Buitkamp 等 1991a，1991b；Schafer 等1988；May 等 1991；Nuraburg 等 1989；Hubert 等 1990；Lonn 等1992；Biermerth 等 1992；Caetano-Anolles 等 1991）。從已有的報道來看，適用範圍廣、變異性高的微衛星探針主要有（GTG）n、（GT）n、（GATA）n、（GACA）n、（GAG）n 等（Buitkamp 等1991a，1991b）。

1.5.3 PCR 在DNA 指紋分析中的應用

PCR 是一種在體外大量擴增DNA 的方法。在法醫研究上，由於所檢驗的材料量（如血斑、精斑、發梢）極微，因此很難獲得常規Southern 雜交所需的DNA 量，利用PCR 就可以解決這一問題。Jeffreys 等（1988）根據多個小衛星的已知側翼序列來合成引物（每個小衛星兩個引物）。先以極微量（甚至單個細胞）的人類基因組DNA 為模板進行體外擴增（產物可長達10kb），然後再用這些小衛星的混合探針進行Southern 雜交，得到了可以重複做出的具有高度變異性的DNA 指紋圖譜。

1.5.4 單位點高變異性小衛星和微衛星探針的開發

DNA 指紋圖譜雖然具有很多的優點，但並非完整無缺。第一，DNA 指紋圖譜中每一個個所含圖帶數很多，給統計分析帶來了許多麻煩。例如，在比較個體之間的DNA 指紋圖譜時，如果某兩條帶的位置相差很小，那麼就很難判斷它們是否來自同一位點上的同一等位基因，也許是由於實驗操作過程中凝膠變形等引起的誤差影響了分析結果的準確性。第二，DNA 指紋圖帶的解析度很難提高，特別是較小的DNA 片段因難以分開而呈現很低的變異性；長度相差不大的DNA 片段無法通過電泳分開。第三，DNA 指紋圖譜不能區分雜合體和純合體。在進行DNA 指紋圖譜統計分析時，人們假定圖中每一條帶分別代表不同的位點，但實際上，如果某一位點是雜合的，那麼此位點在DNA 指紋圖譜上會擁有兩條帶，也就是說在DNA 指紋圖譜上應有兩條帶代表同一個雜合位點上的不同等位基因。因此，有時以DNA 指紋圖譜分析得到的結果與真實情況也會有所不同。第四，對於某一個位點來說，往往只有一個等位基因出現在DNA 指紋圖譜上，因此無法根據DNA 指紋圖譜確定個體在該位點上的基因型。為了克服DNA 指紋圖譜的上述缺點，人們已開始重視單位點探針的開發。所謂單位點探針，是指只是特異性與某一位點上的等位基因雜交的探針。由於真核基因組中的小衛星和微衛星位點普遍具有高度的變異性，因此它們是高變異單位點探針的重要來源。基因組中的小衛星位點有數千個，微衛星位點更達數十萬個，通過用現有的多位點小衛星和微衛星探針篩選基因文庫，可以得到眾多的高變異單位點探針。迄今為止，國外一些單位已從豬、馬、雞、牛等的基因組中分離、克隆了數百個小衛星和微衛星探針，這些探針將是構建有關畜禽基因圖譜的基礎。

1.5.5 其他方面的進展

雙向電泳（two-dimensional electrophoresis）的應用，使 DNA 指紋圖譜的容量大大增加（Uitterlinden 等 1989）。變性凝膠電泳可以更有效地分辨等位基因（Uitterlinden 等1989）；電極反轉電泳（field inversion gel electrophoresis）提高了 DNA 指紋圖譜中大片段的解析度（Fowler 等 1988）。由於DNA 指紋圖譜在實驗技術和統計方法上一直處於不斷的改進之中，因此我們深信在不遠的將來，DNA 指紋分析技術必將在醫學、畜牧業、農業乃至整個生物領域得到更加廣泛的應用。

2.1 主要試劑及器材

產生 DNA 指紋圖譜的主要試劑及器材如下：限制性內切酶 HinfⅠ、HaeⅢ等；電泳級瓊

脂糖；尼龍膜；λDNA/EcoRⅠ+HindⅢ；H4 型（24×20cm）水平電泳槽裝置；Model 250 型

電泳儀；標記試劑盒 Prime-a-Gene® Labeling system；（α-32P）dCTP；X 光膠片；LS5801

型液閃儀；FYY-1 型多功能生化反應儀。

2.2 有關試劑的配製

（1） ACD 抗凝劑

檸檬酸 0.48g

檸檬酸鈉 1.32g

葡萄糖 1.47g

加水至 100ml

（2） T10E10 緩衝液

Tris-HCl 10mmol/dm3

EDTA 10mmol/dm3

pH 值：8.0

（3）TE 緩衝液

Tris-HCl 10mmol/dm3

EDTA 1mmol/dm3

pH 值：8.0

（4）20%SDS（100ml）

SDS 20g

溶於 100ml 蒸餾水中，30℃以上貯存。

（5）USSTE 裂解液

Urea 8mmol/dm3

NaCl 0.3mol/dm3

SDS 2%

Tris-HCl 150mmol/dm3

EDTA 1mmol/dm3

pH 值：7.5

（6）Tris 飽和酚

新蒸苯酚加入 8-羥基喹啉至終濃度為 0.1%，用 1mol/dm3 Tris-HCl 和0.5mol/dm3

Tris-HCl 溶液飽和至 pH 值 8.0，去掉上層水相，加適量（約 1/10 體積）的 0.1mol/dm3 Tris-HCl

（pH 值8.0）覆蓋在酚相上，保持4℃，放在棕色瓶中保存。

（7）50×TAE 緩衝液（1 000ml）

Tris 242g

冰醋酸 57.1ml

0.5mol/dm3 EDTA（pH 值 8．0） 100ml

（8）10× BPB 貯存液

聚蔗糖 20%

EDTA 0.2mol/dm3

溴酚藍 0.25 %

二甲基腈藍 0.25%

本貯存液可在室溫存放。

（9）40mmol/dm3 亞精胺

亞精胺 0.58g

將亞精胺溶於 10ml 蒸餾水中，4℃下存放。

（10）溴化乙錠（EtBr）貯存液（10mg/ml）

EtBr 1g

將EtBr 溶於 100ml 蒸餾水中，在棕色瓶存放，溫度保持在 4℃。

（11）變性液

NaCl 1.5mol/dm3

NaOH 0.5mol/dm3

（12）20×SSC（1 000ml）

NaCl 175.3g

檸檬酸鈉 88.2g

用 10mol/dm3 NaOH 調 pH 值至 7．0，高壓滅菌。

（13）雜交液

NaPO4 0.5mol/dm3

SDS 7 %

EDTA 1mmol/dm3

（14）標記反應終止液

聚葡萄糖藍 0.9%

溴甲酚紫 0.03%

EDTA 20mmol/dm3

4℃下存放。

（15）SephadexG-50 的水化

SephadexG-50 10g

將 SephadexG-50 溶於約 300ml TE（pH 值 8．0）中，高壓滅菌，4℃下存放。

（16）閃爍液（500ml）

無水乙醇 10ml

PPO 2g

PoPoP 50mg

二甲苯 490ml

室溫棕色瓶存放。

2.3 操作步驟

2.3.1 基因組DNA 的提取

（1）10ml 全血與 40mlT10E10 緩衝液混勻，4 000r/min 離心10 分鐘。

（2）棄上清液，在沉澱中加入 40mlT10E10 緩衝液混勻，4 000r/min 離心 10 分鐘。

（3）棄上清液，在沉澱中加入 40mlTE 緩衝液混勻，4 000r/min 離心 10 分鐘。

（4）棄上清液，在沉澱中加入10mlUSSTE 裂解液，混勻呈濁液，置搖床過夜，溫度保持

在37℃。

（5）加入 10ml 苯酚，緩慢上下混勻至少 20 分鐘，4 500r/min 離心 20 分鐘。

（6）用移液槍小心地將上層水相轉移到另一離心管中，吸頭的尖端剪去一小段，以免在

吸取過程中損傷大分子DNA。

（7）向水相中加入等體積的酚、氯仿、異戊醇（體積比為24:23:1），緩慢上下混勻15

分鐘，4 500r/min 離心20 分鐘。

（8）如前述吸出水相，向水相中加入等體積的氯仿、異戊醇（23:1），上下緩慢混合10

分鐘，4 500r/min 離心 20 分鐘。

（9）吸出水相，向水相中加入2 倍體積的預冷（—20℃）無水乙醇，蓋緊管蓋，上下顛

倒即可看見白色絮狀DNA。

（10）小心將絮狀DNA 吸（吸頭尖端剪去一小段，端部必須光滑）至1 .5ml 離心管中，加

入 1ml 70%的乙醇，來回顛倒數次離心管，10 000r/min 離心 2～5 分鐘。

（11）小心地倒掉管中乙醇，將管倒置在乾淨的吸水紙上，以讓乙醇流盡。

（12）將離心管正立，置45℃烘箱中烤20 分鐘左右，以便讓乙醇完全揮發掉，如有條件，

可置於真空乾燥器中抽氣10 分鐘。

（13）取出離心管，視沉澱塊的大小加入 100～200μl TE 緩衝液，置55℃水浴中過夜，以

溶解 DNA。

（14）將溶解后的 DNA 置於 4℃或—20℃下貯存。

2.3.2 基因組DNA 的酶切

（1）每樣酶切反應為：

10μg DNA

1.5ml（15u）限制性內切酶

6μl 10 倍 buffer

6μl 40mmol/dm3 亞精胺

加雙蒸水至體積為60μl，用吸頭混勻。

（2）37℃水浴，保持6～8 小時。

（3）取出酶切樣品置於4℃下。

2.3.3 基因組DNA 酶切情況檢查

（1）從每個酶切樣品中取出3μl 消化液，加入3μl 2 倍BPB 混勻後點樣。

（2）用 0.8%瓊脂糖凝膠（內含 0.5μg/ml EtBr）和 1 倍TAE 緩衝液進行電泳，電壓為60V。

（3）1 小時后，在紫外燈下檢查酶切是否完全及各樣品的DNA 濃度是否一致，以確保每個樣品進行電泳時上樣量一致。

（4）如果發現某個樣品酶切不完全，則另外加入5μl 左右的酶，在37℃條件下水浴保溫6 小時。

（5）已完全酶切的樣品，加入1/10 體積（6μl）的電泳上樣緩衝液（10 倍BPB），混勻後置4℃（短期）或—20℃（長期）保存。

2.3.4 大板凝膠的製備和電泳

（1）稱取3.75g 瓊脂糖，將其倒入一個500ml 容積的普通試劑瓶（透明度要高）中。用蒸餾水將50 倍TAE 貯存液稀釋成1 倍TAE，量取375ml 1 倍TAE 加入瓶中，配製的凝膠濃度為 1.0%。

（2）蓋上瓶蓋，但不能旋得太緊。將瓶放入微波爐中加熱，待瓊脂糖完全熔化后，溶液是透明的。

（3）取出瓶子放在55℃的水浴箱中，約30 分鐘后就能冷卻至55℃。

（4）洗凈並擦乾制膠板（24cm ×22cm），用 2cm 左右寬的透明膠布將制膠板的兩個開口端封牢，放置在水平檯面上用水平儀調平。將樣品梳（ 6mm × 3mm ）插入制膠板離最近開口端 2cm 位置。將冷卻至55℃的凝膠搖勻，緩慢地倒入制膠板中央，如果有氣泡出現，應用吸頭將氣泡吸掉，60 分鐘后，制膠板中的凝膠將完全凝固。

（5）將 50ml 50 倍 TAE 貯存液倒入電泳槽中，再加入 2 450ml 蒸餾水與其混勻，電泳槽也應置於水平檯面上。

（6）將制膠板兩端的透明膠布剝離，然後將制膠板放在電泳槽的中部，小心地拔出加樣梳，以免加樣孔破裂。

（7）從 4℃冰箱中取出 DNA 樣品，另取兩個離心管，各加入 12μl（1μg/8μl）的分子量標誌物λDNA/EcoRⅠ+Hind Ⅲ 及 1/10 體積的（1.2μl）10 倍 BPB，混勻。將 DNA 樣品及分子量標記物一起置於55℃水浴箱保溫10 分鐘，取出后立即置於冰水混和物中，2～3 分鐘後點樣，這樣可防止粘性末端之間的粘接。

（8）加樣時每個樣品用一個吸頭，以免交叉污染。吸出樣品后應迅速插入加樣孔中下部，輕輕推出樣品，在兩端加樣孔中各點入分子量標誌物。

（9）蓋上電泳槽蓋，插上導線，在加樣后5 分鐘接通電流，以留出時間使加樣孔內的樣品通過擴散而均勻分佈，將電壓調至30V，電泳60 小時。2.3.5 Southern 轉移

（1）電泳結束后，將制膠板連同凝膠一起放在一個方形塑料盤中，倒入約350ml（浸沒凝膠）的 0.2mol/dm3HCl 處理 25 分鐘，並每過約5 分鐘搖動一次。

（2）倒掉稀鹽酸溶液，加入蒸餾水簡單地洗滌一下凝膠，然後倒掉蒸餾水，加入約350ml的變性液浸泡30 分鐘，間斷性地搖動。

（3）倒掉變性液，加入350ml 0.5 倍變性液浸泡 25 分鐘，間斷性地搖動。

（4）將制膠板連同凝膠一起取出，將一塊約28cm×19.5cm 的玻璃板蓋在凝膠上，極其小心地將制膠板倒翻過來，這時玻璃板在下，凝膠在上，輕輕地滑出制膠板，將玻璃板連同其上的凝膠放在水平的桌面上。

（5）將一張20cm×19cm 的尼龍膜（註明樣品排列方向及電泳方向）在0.5 倍變性液中浸濕，然後對齊凝膠小片段區域的頂端將尼龍膜鋪在凝膠的表面，用一根玻璃棒從膜的表面推過以趕走膜與凝膠之間的氣泡，用牆紙刀切除掉凝膠的無用部分（未被尼龍膜覆蓋住的部分）。操作時應戴上手套或用鑷子。

（6）將3 張稍大於膜的濾紙（20cm×20cm）依次在 0.5 倍變性液中浸濕，放置在膜上，每放一張濾紙后都應用玻璃棒輕輕趕走氣泡。

（7）將一打（約4～5cm 厚）已裁至濾紙大小的干吸水紙放在濾紙層上，再將一塊玻璃板放在吸水紙上，然後抓緊上下兩塊玻璃板迅速翻轉放在水平桌面上，抽去凝膠上面的玻璃板。

（8）在凝膠的四周露出的濾紙及吸水紙上放上保鮮膜，以防止凝膠上下的濾紙直接接觸。然後將 5 張稍大於凝膠的濾紙（20cm ×20cm）依次在 0.5 倍變性液中浸濕，放置在膜上，每放一張濾紙后都應用玻璃棒輕輕趕走氣泡。

（9）用一層保鮮膜將整個轉移裝置圍蓋住，以防水分蒸發，將一塊玻璃板壓在頂部。

（10）持續轉移3～4 小時后，去掉上面的濾紙和凝膠，取下尼龍膜放在2 倍SSC 中浸泡20 分鐘，間斷性搖動，然後取出放在一張乾淨的濾紙上，置60℃烘箱中烘30 分鐘，使DNA固定於尼龍膜上。

（11）將烤乾的膜夾在兩張乾燥濾紙之間，置於室溫下保存待用。

2.3.6 探針的標記

（1）將80ng 探針DNA（體積<30μl）倒進一個新的0.5ml 離心管中，在沸水中煮5～10分鐘，取出，插入碎冰中。

（2）然後依次在試管中加入下列成分：10μl 5 倍標記緩衝液（含隨機引物），2μl BSA（10mg/ml），2μl dATP、dGTP、dTTP 等量混合物（濃度為各 20μmol/dm3）；30μl 滅菌蒸餾水，50μl（α-32P）dCTP（10μCi/μl，3 000Ci/mmol）（至濃度為 333nmol/dm3）；lμl Klenow酶（3u/μl）；最後體積為 50μl。

（3）將全部試劑混勻後置37℃保溫壺中保溫6 小時。

（4）加入等體積（50μl）的標記反應終止液終止反應。

2.3.7 未摻入核苷酸前體的除去

（1）取一0.5ml 離心管，在管底部打一小孔，用玻璃棉塞住小孔，外套一個1.5ml 離心管。

（2）向0.5ml 的管中加滿TE 飽和的Sephadex G-50。

（3）3 000r/min 離心 5 秒鐘，重新加滿Sephadex G-50 后再離心，直到 Sephadex G-50加滿0.5ml 小管的3/4。

（4）將標記反應液加入 0.5ml 管中，3 000r/min 離心數秒鐘。

（5）將1.5ml 管中的液體（藍色）移入另一1.5ml 離心管中。

（6）向0.5ml 管中加入 40μl TE，3 000r/min 離心數秒鐘。

（7）重複（5）、（6）步驟2～3 次，直到凝膠中的紫色即將到達0.5ml 管底部。

（8）將回收的探針置於4℃下待用。

2.3.8 探針放射性強度的測定

（1）取兩個液閃瓶，各加2ml 閃爍液。

（2）在其中一個液閃瓶內加入2μl 原標記反應液。

（3）在另一個液閃瓶內加人2μl 去除了未摻入核苷酸的回收液。

（4）將2 個液閃瓶置於液閃儀中，測定其cpm。

2.3.9 Southern 雜交

（1）將 25ml 雜交液放入方形塑料盒中，於 55℃下預熱。

（2）將待雜交的膜和雜交液一起放入水浴搖床中。

（3）在55℃下預雜交1.5 小時左右。

（4）將放射性探針放在沸水中5 分鐘，取出后迅速插入冰水中。

（5）在雜交液中按5×105cpm/ml 的濃度加入變性的探針。

（6）在55℃下雜交約15 小時。

（7）將雜交液中的膜取出，放入1 倍SSC 溶液中於55℃下漂洗10 分鐘。

（8）倒去1 倍SSC 溶液，在55℃下用1 倍SSC 溶液及0.1 %SDS 洗脫液漂洗40 分鐘。

（9）倒去洗脫液，55℃下用新的1 倍SSC 溶液及0.l%SDS 洗脫液漂洗30 分鐘。

（10）將膜放入1 倍SSC 溶液中，於室溫下漂洗10 分鐘。

（11）取出膜，平攤在潔凈、乾燥的濾紙上。

（12）當膜上無水珠、膜仍濕潤時，用保鮮膜將膜包好準備壓片。

2.3.10 放射自顯影

（1）在暗室或微弱安全光條件下，打開X 光曝光暗盒。

（2）放入一張增感屏，光滑面朝上。

（3）將膜放在增感屏上（膜與膜之間不能重疊）。

（4）置X 光膠片於膜上。

（5）將另一張增感屏光滑面朝下放在X 光膠片上。

（6）蓋緊X 光暗盒，置—70℃冰箱內曝光1～7 天。

2.3.11 X 光膠片的沖洗

（1）顯影：將X 光膠片從暗盒中取出，放入顯影液中，間斷性搖動數分鐘。

（2）停顯影：將X 光膠片放入1.5%的冰醋酸溶液中漂洗數秒鐘。

（3）定影：將X 光膠片轉入定影液中定影數分鐘。

（4）沖洗：將定影完畢的X 光膠片放在流水中沖洗20 分鐘，然後晾乾。

2.3.12 放射性探針的除去

（1）將300～500ml 蒸餾水煮沸。

（2）往蒸餾水中加SDS，至最終濃度0.l%。

（3）將放射自顯影后的膜浸入其中。

（4）待冷卻至室溫時將膜取出、烘乾，即可用於另一種探針的雜交。

3.1 分析範圍及標準

所有圖帶分析均在X 光膠片上進行，所分析的圖帶大小範圍為 2.0～23.0kb。膠片上那些位置相同（即分子量相同）、顯影強度基本一致的圖帶被看作是完全相同的帶。將同一膠片上的個體兩兩配對比較，找出相同的圖帶。在分析過程中，假定所有相同的帶均來自同一位點上的同一等位基因。

3.2 DNA 指紋圖譜的共有帶率

（Band-sharing，簡稱BS）BS 的計算公式為：

BS=2NAB/（NA +NB ）

式中：NA 指個體A 的圖帶數，NB 為個體B 的圖帶數，NAB 指個體A 和個體B 共有的圖帶數。

3.3 平均等位基因頻率及最低平均雜合率

平均等位基因頻率（q）及最低平均雜合率（Ht）

計算公式為：

q =l—（1—BS）1/2，Ht=l—q

式中BS 為共有帶率。

3.4

兩個個體具有完全相同的DNA 指紋圖譜的概率（P）兩個無關個體具有完全相同的DNA 指紋圖譜的概率為：P1 = （1—2BS+2BS2 ）n/BS ；兩個同胞個體具有完全相同的DNA 指紋圖譜的概率為：P2 =[1—0．5q（1—q）2（4—q）]n/BS。式中：n 為個體的平均圖帶數，q 為平均等位基因頻率。

3.5

一個探針可能檢測到的位點總數（N）和可檢測到的不同位點數（L ）的估計計算公式為：

N = [（n —b）（n —b － 1）/2a 十 1]/2；L =n －a —b

式中：n 為可見帶數，a 為等位位點數，b 為連鎖位點數。

3.6

DNA 指紋圖帶的家系遺傳分析根據孟德爾遺傳規律，可以假定每一條只在一個親本上存在的圖帶（雜合帶），遺傳給後代的概率為0.5（小衛星位點之間沒有連鎖和突變）。一個親本的所有雜合帶在子代中出現的次數符合二項式分佈，對二項式分佈進行適合性檢驗，即可判定這些雜合帶是否符合孟德爾遺傳規律。

卡方的計算公式為：

X2 = Σ[（O—E）2/E]

式中：O 為觀察到的雜合帶出現的次數，E 為期望次數（二項式對應的每一項概率乘以總次數）。自由度df =N—l。

傳遞率的計算方法為親本DNA 指紋圖譜中每一條帶在所有後代中出現的次數與後代個體數之比的算術平均值。