微繁殖

微繁殖（micropropagation）又稱離體繁殖（in vitro propagation）是指利用植物組織培養技術，在離體條件下對植物進行營養繁殖。

微繁殖是過去30年中發展起來的一項技術，也是植物組織培養應用最廣、最多和最有成效的一個方面。Georges Morel最早應用莖尖培養作為無性繁殖手段，1960年他在蘭花、蘭屬植物無性系建立以後，為離體無性繁殖開闢了廣闊的前景。自1974年以來，已經對130個屬的近1000種植物種類進行了微繁殖，創造了巨大的經濟效益，其中最主要是花卉觀賞植物，已經進行微繁殖的有近80個屬的450種植物，其次為果樹林木、蔬菜和農作物等。

與常規的有性繁殖和無性繁殖相比，微繁殖可以在短期內，利用少量外植體或起始材料，在較小的空間內快速生產，具有小型、高效、高產、高經濟效益等特點，並可加速優良品種、新引入品種和育種材料的繁殖推廣過程，縮短打入市場所用的時間。

許多果樹和園藝植物高度雜合，或種子為雌雄株產生的自然雜種，利用實生繁殖常會產生分離和變異，與親本植物在遺傳和表型上不一致。而無性繁殖則可避免上述缺點，產生出與親本完全一致的後代。另外，某些植物種類，如香蕉、葡萄、無花果、矮牽牛花和菊花等，產生的種子很少或種子不能成活，而三倍體或多倍體植物材料，也只能通過無性繁殖手段進行。

有一些植物種子的休眠期很長，或從播種到開花結實的周期極長，這些植物一般也採用營養繁殖。利用植物組織培養技術進行微繁殖，不僅具有上述營養繁殖優勢，而且某些植物種類只能通過組織培養來繁殖，因為只有離體培養才可能發生真正的復幼。

微繁殖的另一個優點是在超凈環境下繁殖和保存苗木，具有無病、無毒、無蟲害等優點。一般微繁殖的起始材料是經嚴格選擇的材料，或是經莖尖培養或莖尖培養與熱處理結合的脫病毒材料、微繁殖生產出的大量脫病毒植株既可直接種植，又可作為常規繁殖面建立原種圃，如觀賞植物水仙屬（Narcrissus）、鳶尾屬（IVIS）、百合屬（Lilium）以及漿果作物如草莓和醋栗。這方面的一個最好的例子就是脫病毒微型薯生產。馬鈴薯在田間種植容易感染病毒，種植若干代後會引起產量下降、品質變劣，所以須經常更換脫病毒微型薯，而微繁殖可快速地生產出脫病毒種薯來。

組織培養生產的苗木比常規繁殖出來的苗木生長更快、更旺盛。這可能是由於復幼或脫除病害的原因。

微繁殖由於環境條件（培養基和物理條件）的可控制性，可以做到有計劃、定時、定量生產，可靈活適應市場需求，還可避免季節和氣候的影響，實現周年生產。

微繁殖有時可以越過植物發育的幼年階段，直接成花或結實。

微繁殖生產自根苗，不必經嫁接或芽接到根砧上，節省了勞動力，對於杜鵑花、玫瑰和

百合花繁殖具有重要意義。以生產自根苗為目的，對果樹接穗品種進行微繁殖將打牙一個新的研究領域，為傳統的果樹園藝帶來新的變化（如建立離密度種植園等）。

微繁殖可以結合低溫種質保存建立基因庫或種質庫。微繁殖材料便於國內國際間種質交換。

①遺傳穩定性差。

②離體繁殖植株表現叢生（bushiness，側枝重複增生）或向幼年階段的完全逆轉。

③某些木本植物難以誘導形成根，或離體形成的根沒有功能，移栽后需產生新的根系，適應外界土壤環境。

④某些植物馴化移栽極為困難。

⑤微繁殖植物在向大田移栽后，由於缺乏免疫能力，存在被新的病源微生物感染的危險。在熱帶作物油棕的種植中，採用多克隆種植可以避免出現這樣的問題。同時要嚴格控制田間病蟲害的發生。

⑥愈傷組織和細胞懸浮液多次繼代培養後會喪失再生能力。

⑦某些情況下難以無菌遊離。

⑧微繁殖目前屬於勞動力密集型產業，除了需要昂貴的專用設備和儀器外，還需工人技術、操作熟練，因而成本較高，所以一般只用來生產那些具有重要商業價植的植物或植物次生代謝產物。

在微繁殖階段的劃分上，Murashige（1974，1977,1978）將微繁殖劃分為三個階段：階段Ⅰ,無菌培養的建立；階段Ⅱ，苗芽增殖；階段Ⅲ，對首芽進行移栽。Debergh和Maene（1981）提出四個階段的劃分法，即階段0，在衛生環境下準備原種株；階段Ⅰ，無菌培養的建立；階段Ⅱ，誘導分生組織中心區，使其迅速發育成增殖芽；階段Ⅲa，苗芽伸長及形成莖齊一致的無根苗；階段Ⅲb，生根及試管苗在無土基質中初步生長。Pierik(1987)及Debersh和Read（1991）則將微繁殖劃分為如下幾個階段：

階段0：準備階段。在這個階段主要對起始材料進行恰當的預處理，如將植物材料種植在無病蟲害的溫室或進行水培，保持植物材料乾燥，防止病蟲害的發生等。

階段Ⅰ：起始培養，無菌培養的建立或初代培養的建立。對分生組織、莖尖或其他外殖體進行消毒，無菌遊離和接種，使生長和發育不受污染影響。

階段Ⅱ：增殖或繁殖階段。該階段主要目的是進行數量上的擴大繁殖，並保證遺傳穩定性。

階段Ⅲ：伸長及根的誘導和發育。準備對階段Ⅱ中得到的無根苗或植株進行移栽，包括停止腋芽增殖、啟動苗芽伸長生長（或壯苗生長）、根誘導和根發育。生根既可離體生根，也可在後一個階段中進行瓶外生根。

階段Ⅳ：馴化和移栽。將完莖植株向溫室和大田的土壤進行移栽。然而上述劃分並非絕對，微繁殖階段的劃分與植物種類和微繁殖方式有關。在許多植物的微繁殖中，伸長培養是同生根培養階段結合在一起的，也有的是同增殖及生根階段結合在一起的，如葡萄及棗樹採用單芽莖段繁殖時就是這樣。但在另一些植物中，伸長培養是作為單獨一個培養階段，如苞葉芋（Spathi phyllhum）和扁桃。這是因為增殖后形成的微型苗芽在培養後期中單個苗芽不便於操作；不夠健壯的苗芽在生根中反應也差，如生根率低或單株生根數少等，而且直接影響到以後的移栽成活率。難生根的果樹微繁殖中，在加有較搞濃度的CK的增殖階段后，緊接著進行一個低濃度CK或預設CK的壯苗階段，可以改變植物體內內源激素水平的平衡，有利於生根。如果採用瓶外生根的方法，那麼階段Ⅲ和階段Ⅳ也可以合二為一。採用田間或野外的植物材料進行培養，則無需階段0。一般而言，在不同的繁殖階段，培養基成分也有差異，有時培養條件也會發生較大的變化。植物的微繁殖：微繁殖方式

不同的植物種類微繁殖的難易程度不同。木本植物和草本植物相比，再生能力相對弱一些，增殖率也低。一般木本植物生長在野外，消毒較為困難，易受生長條件、氣候和季節變化影響。另外，休眠現象和褐化現象會對本本植物的微繁殖造成較大的影響。木本植物比農業和園藝作物更易發生遺傳變異，一般在成齡階段才被用來進行無性繁殖；但成齡材料又極難進行離體培養，尤其是難以生根。同時木本植物又難以誘導復幼。所以，這些都對微繁殖方式和微繁殖階段造成重大影響。其中最主要的因素是再生能力，除基因型存在的差異之外。起始材料的發育階段顯著影響再生能力。一般幼嫩的植物比成齡的植物具有較高的再生能九由於一般選用成齡木本植物進行營養繁殖，因而必須在使用前進行復幼。復幼的方法有分生組織培養；連續扦插；將分生組織或望塵嫁接到實生苗根砧上；遊離幼嫩區；過度修剪，挺進幼嫩側技產生。另外，不定芽發生或胚胎髮生雖然常可誘導復功，但這兩種方式有可能產生變異，所以通常通過分生組織培養來誘導復幼。分生組織培養可以保持遺傳穩定性，消除真菌和細菌，甚至可得到脫病毒材料。如果採用成齡植物材料進行離體營養繁殖遇到困難時，可先採用實生苗或幼態材料進行研究（種子消毒后離體播種萌發；得到的實生苗材料進行離體器官形成）然後從中獲得有關信息，再利用成齡樹體材料進行微繁殖。

在微繁殖方式劃分上，這裡根據起始培養材料和植株再生或發育方式，劃分為單芽莖段培養、腋芽增殖、不定芽（器官）發生、原球莖增殖、體細胞胚胎髮生、細胞和原生質體再生。這種劃分並不嚴格，只是為了方便論述。實際上，目前切實可行的只有前面四種，而且也是絕大多數植物的最主要的微繁殖方式。

單芽莖段培養也稱單節培養（Single-node culture）或微型扦插（microcutting）。它與傳統的扦插法進行營養繁殖極為類似，是指離體培養帶一個芽的莖段（單個莖節或微型插條），使頂芽或腋穿發育成苗（有根苗或無根苗），繼代增殖培養時，再將新形成的苗按芽數或葉數分割成單芽莖段進行培養，新形成的葉的葉腋中有腋芽，它會同頂芽一樣分別發育成苗。如此繼續下去，直到達到一定的苗數，然後進行生根或移栽。這種方法一般不需要添加細胞分裂素來打破頂端優勢，促使腋芽發育。有時可加入少量生長素，不僅腋芽得到發育，同時也會產生較好的根。

這種微繁殖方式的增殖速度同其地方式相比並不高，增殖率依賴於每一次繼代培養結束時的有效芽數（或節段數），一般為4～6周內增殖3~5倍。葉數越多，腋芽數也就越多，增殖率也就越快。如果叢簇病感染機會高時，該方式不能對叢簇（病）植物如鳳梨科（Bromeliaceae）和非洲菊等進行繁殖。為了減少污染或感染幾率，須採用未萌發的芽。如果存在內部感染，必須首先採用分生組織培養獲得衛生植株。溫帶果樹存在休眠現象時，可在離體培養后採用下述辦法打破休眠：低溫處理（0～5°C），長日照處理（每天光照16小時），或低溫處理後接著長日照處理。有時加入赤霉素或（和）細胞分裂素可以打破休眠，促進萌發。黃化處理（黑暗或低強度光照）也可打破休眠。許多情況下（主要是草本植物）既不需要低溫也不需要長日照就可打破休眠。幼齡枝條生長一般比成齡枝條迅速。木本植物成齡材料難以生根，須首先採用幼嫩材料或誘導復幼。

單芽莖段方法還可將離體花芽原基（花序）轉變成營養枝條，如花椰菜。該法還適用於番茄、黃瓜和茄子的培養。番茄具有極強的頂端優勢，無法用腋芽叢生的方法繁殖，而單芽莖段培養卻十分有效。

該法較為簡單，一般可保持遺傳穩定性，步驟少（可一次成苗），但僅適用於自然狀態下能生（側）枝的植物。

促進腋芽分枝（enhanced axillary branching）又稱腋芽法（axlllary bud method）或腋芽叢生法。該法與腋芽莖段培養相似，都是通過莖節書段或莖尖或莖尖切塊的胞芽進行增殖，只是前者通常在含適量細胞分裂素（常為BA）的培養基（合或不含生長素）上以叢生芽的方式〔clulster of Shoots或multiple shoots）增殖，而單芽莖段則在無細胞分裂素的培養基上以單個不分枝的萌芽發育。在繼代增殖培養中，叢生芽被分割成單個苗芽或小苗芽團，轉接在新鮮的培養基上繼續增殖。這種過程可以無限制地進行下去。草莓採用這種方式增殖，在2周內可增加10倍，一年內一顆草莓母株可產生幾百萬株（156～256）的草莓試管苗。一般作物也可以在一月內實現5～10的增殖率。實際上，增殖程度受勞力和設備的限制而達不到這麼高。

腋芽位於葉腋中，每個腋芽都有潛力發育成一個枝條。在自然狀態下的不同時期內，根據植物生長格局，這些腋芽保持休眠狀態。對那些受頂端優勢抑制腋芽萌發的植物，去除或損傷頂芽常可刺激腋芽發育成主幹枝條。頂端優勢受生長調節物質相互作用控制。施用細胞分裂素可解除頂端優勢的抑制作用，在頂芽存在的情況下也可刺激側芽生長，產生早生腋芽（precocious axillary shoots）或叢生芽。這種效果是暫時的，當外源生長調節物質減少時，腋芽就停止生長。

目前這種方法已成為最重要的離體繁殖方法，廣泛用於園藝、農林果樹作物的繁殖。之所以如此是由於其方法簡便，繁殖速度快，還有一點就是可保持遺傳穩定性。由於莖尖或分生組織均為二倍體（對於二倍體植物），受遺傳嚴格控制，不易受培養條件影響而產生基因型變化。腋芽增殖產生的枝條是自原本存在的營養分生組織發育而來，保持原無性系的基因型和表現型。

利用成齡植株的莖尖或分生組織進行培養，在若干次繼代培養后就可得到復幼。這種方法類似於傳統的非離體條件下的連續扦插。復幼程度取決於離體分生組織大小、繼代培養次數和培養基中生長調節物質的濃度。同樣，嫩芽法繁殖速度也不穩定，受繼代培養次數影響；繼代培養次數越多，復幼就越快。例如，在一年內繼代培養12次，就可將30年樹齡的巨桉（Eucalyptus grandis）復幼；同樣也可將30～50年樹齡的丁香灌叢（syringa vulgaris）復幼。復幼材料同成年階段的材料相比，形態特徵發生改變（例如葉形），生根潛力得到很大提離，這對於難以生根的果樹林木尤為重要。另外，莖尖過氧化物酶活性也發生變化。在紅杉（Sequoia semperviens）微繁殖中，復幼植物材料內K/Ca比例隨繼代培養次數的增加而增加，並且高於成齡材料。復劫材料內源IAA／ABA比例也高於成齡材料。

除葉腋和莖端以外，從植物體上芽以外的任何部位或組織產生的芽，都稱之為不定芽（adventitious bud）。不定芽發生一般分直接不定芽形成和間接不定芽形成。直接不定芽形成是指不經愈傷組織階段，直接從植物器官及片段產生的不定芽；而間接不定芽形成則先脫分化形成愈傷組織，爾後再分化形成芽。

（一）直接不定芽形成

在傳統的園藝植物無性繁殖中，許多植物都可從不同器官（根、球莖、葉片等）產生不定芽。這種不定苗芽的形成主要來自機械切割分離引起組織內部激素重新分配或刺激合成的結果。如果在特定的培養條件下，這種繁殖率可大大提離。如秋海棠屬（Begonia）通常情況下只沿切口端形成芽；而如果培養在含BA的培養基上，則插條的全部表面都可形成苗芽。該方法的另一個優點是可以利用小到20～50 mg的外植體進行繁殖，在自然情況下是不可能存活的。直接不定芽形成的繁殖速率比腋芽增殖方法都高，對於那些葉片較少（與之相聯繫的葉腋分生組織也少），而體細胞組織具有很高再生能力的植物尤為如此。

誘導不定芽形成一般需要一定的生長素和細胞分裂素組合。大多數植物受生長調節物質作用的“Skoog-Miller模式”控制。一般採用細胞分裂素來促進芽形成，有時高的細胞分裂素與較低的生長素配合有較好的效果。但也有不需要加入任何生長調節物質就可直接再生不定芽的例子，但這並不意味著增加細胞分裂素或（和）生長素就沒有作用，如毛蕊花屬（Verbascum）和虎眼萬年青屬（Ornithogalum）。通常為了高離產生苗芽數目和速度，常加入一定種類及濃度的生長調節物質，儘管加入什麼、加入多少主要根據植物種類和經驗而定。

許多具有特化貯藏器官的單子葉植物也具有很強的不定芽產生能力。風信子（Hyacinthus）和虎眼萬年青（Ornithogalum thyrsoides）的每一種器官幾乎都可以在無激素的培養基上叢生不定芽。

與腋芽叢生法相比，這種直接產生不定芽的方法較為少用，其原因是：能形成不定芽的植物數量小於能形成不定根的植物數量，而且產生變異的幾率高於單芽段培養和腋芽叢生法。另外，這種方法不能對遺傳嵌合體品種進行繁殖。不定芽形成會使嵌合體得到分割，從而產生純粹型植株。從疏芽的蘋果樹節間部位誘導產生的不定芽，在生長習性、坐果特徵及果實著色方面與親本無性系存在差異。這種原因可以歸咎於蘋果無性系存在複雜的嵌合體特性。天竺葵品種Mme salleron是一種遺傳嵌合體，葉片色彩斑駁。如果利用葉柄片段作外植體，不通過愈傷組識階段直接產生不定芽，葉片沒有顯示斑駁色彩，而是綠色葉片或白化葉片。與此相反，莖尖培養產生的植株，其葉片則顯示典型的斑駁色彩。天竺葵品種Rober’s Lemon Rose的葉切段不論是在自然狀態下繁殖，還是離體條件下繁殖，可以產生4～5種不同的類型。

（二）間接不定芽發生

有些植物的細胞可以在培養中無限增殖。植物細胞全能性可以允許植物細胞以不定器官發生方式再生，如果切實可行，這種方法不失為一種增殖率最快的繁殖方法。但是，這種方法由於涉及脫分化和再分化過程，因而有可能產生基因型和表現型上的變異，通過愈傷組織培養以不定芽發生會引起細胞的遺傳不穩定性。例如，石刁柏（Asparagus officinalis）通過細胞和愈傷組織培養表現出多倍性和非莖倍性，而通過芽培養獲得的植株均為二倍體。這種研究主要用於植物品種改良，若要通過這種途徑進行微繁殖，則必須首先進行大量的、長期的工作，對不定芽產生的植株進行田間評價和檢測，得到可靠的遺傳穩定性數據。這種繁殖方法的另一個缺點是不適用於許多重要的作物。這些作物的再生能力有限。但即便是可以適用的作物，愈傷組織再生能力也會隨著培養時間的延長而下降，甚至完全喪失。雖然如此，一些重要的作物如柑橘屬（Citrus）、咖啡、小蒼蘭屬和棕櫚科植物仍只能採用這種方法進行離體繁殖。

（三）根的誘導

所有經單芽莖段培養法、腋芽叢生法，直接和間接不定芽發生髮育好的無根苗都要進行生根培養。

蘭花的離體繁殖方法與前述幾種微繁殖方法有很明顯的差異。Morel（1960）提出的蘭花離體微繁殖方法如下：離體莖尖或側芽培養不形成帶葉的植株，而是形成基部有根狀體的小球狀結構。這種結構形態上與種子萌發時胚形成的原球莖（protocorm）相似，故也稱為原球莖。

莖尖培養中產生的原球莖起源於葉的表皮和亞表皮細胞。將這些原球莖切成數塊後繼代培養，每一塊又能形成若干個原球莖（由表皮細胞產生，原球莖內部組織沒有再生新原球莖的潛力）。這種增殖過程可無限制地進行下去。最開始每個莖尖或側芽大約2個月3～5個原球莖；爾後每個原球莖可切成4～6片，每一片在1個月內又可產生3～5個原球莖。使用這種方法，開始由一個不到lmm的莖尖在1年內可產生幾百萬株蘭花。這種方法很快成為商業性生產的最主要方法。除兜蘭（Paphiopedilum）外，幾乎所有具有經濟價植的蘭花都可以通過原球莖增殖的方法進行離體繁殖。

體細胞胚胎髮生也是一種重要的微繁殖方法。體細胞胚胎髮生可以分為直接體細胞胚胎髮生和間接體細胞胚胎髮生。前者是指不經愈傷組織階段，直接從細胞或組織上產生體細胞胚胎。能發育成體細胞胚胎的細胞稱為前胚決定細胞（pre－embryonic determined Ce11s，PEDC’S）。這種類型的起始材料必須是完全復幼的材料，如柑橘屬（Citrus）的珠心組織可形成多胚，以及野生胡蘿蔔、石龍芮（ranunculus sceleratus）、亞麻（Linum usitatissimum）、芸苔（Brassica napus）品種Tower的下胚肢軸表皮細胞。利用直接體細胞胚胎髮生進行微繁殖的樹種還有椰子。

間接體細胞胚胎髮生是經愈傷組織階段的體細胞胚胎髮生，即先經晚分化，細胞分裂后再決定成為胚性細胞。能夠形成體細胞胚胎的這些細胞稱為誘導胚性決定細胞（induced embryogenica11y determined cells，IEDS’s）。這種方法必須發生完全復幼，如咖啡（Coffea arabica）的葉外植體及胡蘿蔔的次生韌皮部。

體細胞胚胎幾乎可以從各種外植體（包括原生質體和細胞懸浮培養）獲得。利用細胞懸浮培養和愈傷組織培養既可從內部起源，也可從外表起源。一般容易誘導產生體細胞胚胎的起始材料有球心組織、下胚軸、花器官、合子胚，甚至包括花藥、花粉和胚乳組織。

採用節段培養，腋芽叢生和不定芽發生需要先經器官發生途經產生單極性的枝條（或無根苗），然後經一個或一個以上的培養階段才可生根形成完整的植株。與此相反，體細胞胚胎髮生則產生具有雙極性的不定胚，然後經歷一個類似合子胚的發育過程直接形成完整植株，不僅分化頻率極高，可以產生數量更多的植株，而且避開了極為困難的生根培養（木本植物尤為如此）和較長的培養周期。體細胞胚胎髮生是從成齡樹林上得到真正復幼的方法。體細胞胚胎髮生可產生同步化和整齊一致的體細胞胚胎群，可以實現部分機械化，節省勞動力等成本，同時可以生產人工種子。文獻中提到，這種方法會產生變異，但在實際生產中並非主要問題。例如，油棕離體繁殖中有時可以發現多倍體細胞，但體細胞胚胎無一例外是從二倍體細胞起源的，離體繁殖得到的油棕也未表現出值得注意的遺傳變異。

大規模細胞培養可以用來進行體細胞胚胎髮生及人工種子的製作。這種方法可以獲得大量的遊離的體細胞胚胎，但目前能從細胞懸浮培養再生體胚和完整植株的植物種類有限，而且這種方法容易產生變異。目前多用大規模細胞培養生產植物次生代謝物。利用原生質體培養多是出於育種的目的。由於從原生質體培養較為困難，能夠產生植株的植物數量有限，而且這種方法也表現出顯著的遺傳變異。