原生質體

革蘭氏陽性菌經溶菌酶或青霉素（也可用果膠酶以及纖維素酶）處理后，可完全除去細胞壁，形成僅由細胞膜包住細胞質的菌體。

原生質體(potoplast)

脫去細胞壁的細胞叫原生質體，是一生物工程學的概念。如植物細胞和細菌(或其它有細胞壁的細胞)通過酶解使細胞壁溶解而得到的具有質膜的原生質球狀體。動物細胞就相當於原生質體（但與原生質體有一定區別）。

原生質體具體包括細胞膜和膜內細胞質及其他具有生命活性的細胞器，植物和動物的如細胞核、線粒體和高爾基體等；而病毒如核糖體、擬核等。

細胞膜

細胞膜又稱質膜，是指細胞質與細胞壁相接觸的一層生物膜，在光學顯微鏡下不可見，須採用高滲溶液處理后發生質壁分離時，能在是原生質體表面看到一層光滑的薄膜。細胞膜的主要功能包括選擇透性和調節代謝等。選擇透性表現在能阻止可溶性蛋白質和糖等多種有機物從細胞內滲出，同時又能使水、無機鹽和其他的必需營養物質進入細胞，使細胞有一個穩定的內環境。細胞識別功能和細胞膜密不可分，對外界因素的識別過程主要通過與細胞膜上的特異受體結合而起作用，進而調節細胞內的多種代謝途徑。

細胞質

細胞質又稱胞基質，為細胞膜之內的半透明、半流動、無定型的膠體狀基質，是原生質體的基本組成部分，細胞核和各種細胞器分散其中。細胞質為原生質體內各種定型結構提供了分佈場所、代謝活動原料和物質交流空間。

細胞核

除細菌和藍藻外，所有的植物細胞都含有細胞核，通常一個細胞只具有一個細胞核。細胞核位於細胞中央，一般呈圓形、卵圓形，或稍伸長，也有其他形狀的，如某些植物花粉的營養核為不規則裂瓣。細胞核大小相差很大，直徑般為10~20um，在光學顯微鏡下可以觀察到，經過固定和染色后可以看到其內部構造，有核膜、核仁、核液和染色質等四部分。核膜（nuclear envelope）為細胞核的外界膜，在電子顯微鏡下觀察是雙層結構，核膜上有均勻或不均勻分佈的多數小孔，稱為核孔（nuclear pore），是細胞核與細胞質進行物質交換的通道。核液（nuclear sap）是充滿在核膜內的透明而黏滯性較大的液狀膠體，其中分散著核仁和染色質。核仁（nucleolus）是細胞核中折光率更強的小球狀體，通常有一個或幾個，主要由蛋白質、RNA所組成，還可能有少量的類脂和DNA，是核內RNA和蛋白質合成的主要場所。染色質（chromatin）是分散在細胞核液中易被鹼性染料著色的物質，細胞分裂間期為染色深的網狀物，稱染色質;細胞分裂時，染色質可經螺旋狀扭曲形成棒狀的染色體（chromosome）。不同植物染色體的數目、形狀和大小不同，同一物種則相對穩定不變。

染色質主要是由DNA和蛋白質所組成，還含有RNA。DNA和RNA為細胞的遺傳物質，主要集中在細胞核內。細胞核的主要功能是控制細胞的遺傳和生長發育，也是遺傳物質存在和複製的場所，並且決定蛋白質的合成，還控制質體、線粒體中主要酶的合成，從而控制和調節細胞的其他生理活動。細胞失去細胞核，一切生命活動將停止，會導致細胞死亡;同樣，細胞核也不能脫離細胞質而獨立存在。

細胞器

是指細胞質內有一定形狀和位置的顆粒狀或區域功能單位，可由膜包圍或延展形成，也可能是由蛋白質聚集而成。如質體（plastid）、液泡、線粒體、內質網、高爾基體、溶酶體、微管、微絲等。其中質體、液泡與細胞壁是植物細胞區別於動物細胞的三大特有細胞結構。

（1）質體：由雙層膜構成的規則或不規則形狀的顆粒結構，體積比細胞核小，由蛋白質、類脂等組成。質體按含色素類型、結構、功能等可分為三類：葉綠體（chloroplast）、有色體（chromoplast）和白色體（leucoplast）。

①葉綠體：是綠色植物進行光合作用的場所，內部結構精細，所含的色素有葉綠素甲（chlorophyll A）、葉綠素乙（chlorophyll B）、胡蘿蔔素（carotin）和葉黃素（xanthophyll）等脂溶性色素，其中以葉綠素為多，所以呈現綠色。高等植物的葉綠體多為球形、卵形或透鏡形的綠色顆粒狀，低等植物中，葉綠體的形狀、數目和大小隨不同植物和不同細胞而不同。

②有色體：在細胞中常呈針形、圓形、桿形或不規則形狀，內部結構簡單，所含色素有胡蘿蔔素和葉黃素等，使植物呈現黃色、橙色或橙紅色，主要存在於花、果實和根中。有色體對植物的生理作用還不十分清楚，一般認為有三方面，一是其所含的胡蘿蔔素在光合作用中是一種催化劑;二是有色體存在於花部，使花呈現鮮艷色彩，有利於昆蟲傳粉;三是某些部位積累有色體有解毒或儲藏作用。

③白色體：是最小的一類質體，通常呈圓形、橢圓形或其他形狀的無色小顆粒狀，內部結構無分化，不含色素，主要功能為儲藏，根據合成和儲藏物質不同還可以分為三類，即合成澱粉的造粉體、合成蛋白質的蛋白質體和合成脂肪和脂肪油的造油體。多見於不曝光的器官如塊根或塊莖等細胞中。

葉綠體、有色體和白色體在一定的條件下可以相互轉化。如番茄的子房是白色的，因為其子房壁細胞內含白色體，受精后的子房發育成幼果，暴露於光線中時形成葉綠素，白色體轉化成葉綠體，使幼果變綠，果實成熟時，葉綠體又轉化成了有色體，果實即變成紅色。胡蘿蔔根露出地面的部分經日光照射而變成綠色，也是有色體轉化為葉綠體的緣故。

（2）液泡：由單層膜圍成的泡狀結構，膜內充滿細胞液（cell sap），是細胞新陳代謝過程產生的混合液，屬於無生命的非原生質體部分。不同細胞的細胞液組分不同，主要成分除水分外，還有各種代謝物如糖類（saccharides）、鹽類（salts）、有機酸（organic acids）、生物鹼（alkaloids）、揮髮油（volatile oil）、鞣質（tannin）、苷類（glucosides）、樹脂（resin）、色素（pigments）、草酸鈣結晶等，其中不少化學成分具有生理活性，也是植物類藥材的有效成分。幼嫩細胞中，液泡的體積小，數量多，分散分佈。成熟細胞，尤其是薄壁細胞中液泡會合併成一個或幾個大型液泡，佔據整個細胞體積的90%以上，而細胞質、細胞器和細胞核則被中央液泡推擠到細胞的邊緣貼近細胞壁。

液泡的主要功能是調節細胞的滲透壓、積極參與細胞內的分解、物質積累與移動等活動，在穩定細胞內環境上起著重要作用。

（3）其他細胞器：

線粒體（mitochondria）是細胞質內呈顆粒狀、棒狀、絲狀或分支狀的細胞器，比質體小，在光學顯微鏡下經特殊染色可以觀察到。線粒體是細胞中碳水化合物、脂肪和蛋白質等物質進行氧化、呼吸作用的場所，並為細胞生命活動提供所需能量，因此線粒體被稱為細胞的“動力工廠”。

內質網（endoplasmic reticulum）是細胞質內由膜組成的一系列片狀的囊腔和管狀的腔，彼此相通形成一個隔離細胞基質的管道系統。內質網可分粗糙內質網和光滑內質網兩種類型，前者主要功能是合成輸出蛋白質（即分泌蛋白），還能產生構成新膜的脂蛋白和初級溶酶體所含的酸性磷酸酶;後者主要功能是合成、運輸類脂和多糖等。兩種內質網同時存在於一個細胞內，也可互相轉化。

高爾基體（golgi apparatus）主要分佈在細胞核的周圍或上方，是由兩層膜所構成的平行排列的扁平囊泡、小泡和大泡（分泌泡）組成。植物細胞中，高爾基體的功能是合成和運輸多糖，並且能夠合成果膠、半纖維素和木質素，參與細胞壁的形成，還與溶酶體的形成有關，初級溶酶體的形成過程與分泌顆粒的形成類似，都起自高爾基體囊泡，此外，松樹的樹脂道上皮細胞分泌樹脂，根冠細胞分泌黏液等分泌活動與高爾基體有關。動物細胞中，高爾基體的主要功能是將內質網合成的多種蛋白質進行加工、分類與包裝，然後分門別類地運送到細胞特定的部位或分泌到細胞外。多年來研究證明，高爾基體是細胞內大分子加工、分選和運輸的一個重要交通樞紐：①將內質網合成的蛋白質和脂類進行加工、分選與包裝,然後送到細胞特定的部位或分泌到細胞外。②在完成物質轉運的同時，對膜性細胞器與質膜的膜成分不斷更新與補充。因此，高爾基體不僅是物質分泌的運送和接收中心,而且也是膜物質傳遞到細胞表面及膜上的運送和接收中心。

核糖體（ribosome）又稱核糖核蛋白體或核蛋白體，是細胞中的超微顆粒，為蛋白質合成的場所，能將氨基酸裝配成肽鏈。每個細胞中核糖體可達數百萬個。

溶酶體（lysosome）和圓球體（spherosome）均是由單層膜包裹富含多種水解酶的囊泡狀細胞器，主要功能是進行細胞內消化。

原生質體是植物或微生物細胞去掉壁以後的內含物。原生質體的製備主要是在高滲壓溶液中加入細胞壁分解酶，將細胞壁剝離，結果剩下由原生質膜包住的類似球狀的原生質體，它保持原細胞的一切活性。

製備原生質體首先需要選擇供融合的兩個親株。要求親株的性能穩定並帶有遺傳標記，一般以營養缺陷型和抗藥性等遺傳性狀為標記，以利於融合子的選擇。為了使菌體細胞易於原生質體化，一般選擇對數期後期的菌體進行酶處理，這個時期細胞正在生長、代謝旺盛，細胞壁對酶解作用最為敏感，原生質體形成率高，再生率也高。

獲得有活力、去壁較為完全的原生質體對於隨後的原生質體融合和原生質體再生是非常重要的，原生質體製備中的主要影響因素有以下幾方面。

菌體的預處理

在使用脫壁酶處理前，先用化合物對菌體進行預處理，有利於原生質體製備。例如用乙二胺四乙酸（elhylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、甘氨酸、青霉素等處理細菌，可使菌體的細胞壁對脫壁酶的敏感性增加。EDTA能與金屬離子形成絡合物，避免金屬離子對酶的抑制作用而提高酶的脫壁效果。甘氨酸可以代替丙氨酸參與細胞壁肽聚糖的合成，其結果乾擾了細胞壁肽聚糖的相互交聯，便於原生質體化。細菌通常加入亞抑制量的青霉素，以抑制細胞壁粘肽組分的合成，有利於酶對細胞壁的水解作用。

脫壁酶

細菌和放線菌細胞壁的主要成分是肽聚糖，可以用溶菌酶來水解細胞壁。

真菌細胞壁組成較複雜，常用蝸牛酶、纖維素酶、口一葡聚糖酶等來水解細胞壁。酶濃度過低，不利於原生質體的形成，酶濃度增加，原生質體的形成率亦增大，酶濃度過高，則導致原生質體再生率降低。所以，有必要兼顧原生質體形成率和再生率選擇最適的酶濃度，一般選擇原生質體形成率和再生率之積達到最大時的酶濃度作為最適酶濃度。

滲透壓穩定劑

原生質體對溶液和培養基的滲透壓很敏感，在低滲透壓溶液中，原生質體將會破裂而死亡，必須在高滲透壓或等滲環境中才能維持其生存。滲透壓穩定劑的種類有無機鹽和有機物，無機鹽包括NaCl、KC1、MgSO4、CaCl2等。有機物包括蔗糖、甘露糖、山梨醇等。不同微生物採用的滲透壓穩定劑也不同，對於細菌和放線菌，一般採用蔗糖、丁二酸鈉等為滲透壓穩定劑：對於酵母菌主要採用山梨醇和甘露醇，對於黴菌採用KC1和NaCl等，穩定劑使用濃度一般為0.3~0.8mol/L。一定濃度的鈣、鎂等二價陽離子可增加原生質膜的穩定性，所以是高滲培養基中不可缺少的成分。

反應溫度

溫度會影響酶的活性，溫度升高，酶活性增加，溫度過高，酶失活而影響原生質體的形成，一般溫度在20~40℃。

酶解時間

原生質體的形成與酶解時間密切相關，酶解時間過短，原生質體形成不完全，會影響原生質體間的融合；酶解時間過長，原生質體的質膜也易受到損傷，從而影響原生質體的再生，也不利於原生質體的融合。

由於各種微生物細胞壁的組成不同，破壁所用的酶的種類、濃度、破壁處理溫度、時間、pH均有不同，須採用不同的原生質體製備方法。

由於在自然條件下，原生質體發生融合的頻率非常低，因此在實際育種過程中要採用一定方法進行人為誘導融合。兩株出發菌株製備好的原生質體可以通過化學因子或電場誘導的方法進行融合。

化學因子誘導是把兩個親株的原生質體混合在一起，加入融合劑聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）和Ca、Mg等陽離子誘導原生質體融合。PEG具有強烈的脫水作用，擾亂了分散在原生質表面的蛋白質和脂質排列，提高了脂質膠粒的流動性，從而促進原生質體融合。Ca可促進脂分子的擾動，增加融合頻率。電融合過程是原生質體在電場電擊下，原生質體膜會被擊穿，從而導致融合的發生。

融合后的原生質體具有生物活性，但不具有細胞壁，無法表現優良的生產性狀，不能在普通培養基上生長，必須設法讓它長出細胞壁，所以將重新形成細胞壁的過程稱為再生。再生培養基必須具有與原生質體內相同的滲透壓，常用含有Ca、Mg或增加滲透壓穩定劑的完全培養基。把融合的原生質體塗佈於添加滲透穩定劑的高滲瓊脂培養基上，或者把原生質體懸液混合在培養基中，進行瓊脂夾層培養，使其再生細胞壁。增加高滲培養基的滲透壓或添加蔗糖可增加再生率，恢復正常細胞形態后，才能在普通培養基上正常生長。再生率因菌種本身的特性，原生質體製備條件，再生培養基成分及再生條件等不同而由百分之零點幾提高至百分之幾十。

植物原生質體具有以下的特點：①無細胞壁的物理障礙；②能獲得遺傳性狀和生理性狀較一致的細胞群體；③植物原生質體同樣具有全能性；④用組織培養方法可進行大量繁殖。這些有利的特徵決定了原生質體是一個極好的實驗體系，在植物育種上有廣泛用途。

種質資源保存

在20世紀70年代開始了原生質體的超低溫保存研究。有些植物只有在一年的某個特定時期才能成功分離原生質體，超低溫保存的原生質體可以隨時為研究提供所需的材料，並且是研究植物低溫傷害及細胞內結冰的好材料。目前，原生質體已用於一些作物（如玉米、小麥、大豆、曼陀羅、番茄、柑橘等）的超低溫保存。

原生質體融合

原生質體是進行原生質體融合（protoplast fusion）的材料。原生質體融合即體細胞雜交（somatic cell hybridization）技術，具有十分誘人的前景，可以通過不同類型的原生質體融合克服傳統育種方法無法解決的生殖障礙問題，從而創造新的種質材料，還可以實現不同材料的核質基因重組，是植物細胞工程在育種上應用的重要內容。

篩選突變體

在原生質體培養過程中能夠產生體細胞無性系變異，或者在原生質體培養過程中誘導變異，從再生植株中篩選出具有優良性狀的變異體，成為植物育種新材料，或直接育成新品系。

植物遺傳轉化的理想受體

原生質體由於去除了細胞壁，使其容易攝取外源遺傳物質，如細胞器、細胞核、DNA等因而成為植物遺傳轉化的理想受體。這些年來，在利用原生質體的基礎上，建立了多種直接轉移基因的方法，如PEG法、電激轉化法、脂質體介導的轉化、基因槍轉化法、顯微注射法、微焦束激光導入法等。由於禾本科植物（包括牧草、草坪草等）難以採用農桿菌介導法轉基因，主要用直接轉化法，因此，在牧草和草坪草育種中原生質體培養技術尤為重要，是目的基因能得以轉化和表達的基礎和有效的途徑。