植物組培技術

細胞全能性(cell totipotency)：植物體的每一個細胞都攜帶有一套完整的基因組，並具有發育成為完整植株的潛在能力。

植物生長調節物質對於植物細胞組織的分化和決定具有關鍵性作用。它包括：生長素類、細胞分裂素類、赤霉素、脫落酸、乙烯等。

生長素類主要用於愈傷組織的形成，體細胞胚的產生及試管苗的生根。常用的有2,4-D、NAA（萘乙酸）、IBA（吲哚丁酸）、IAA（吲哚乙酸）等。其作用強弱為2,4-D>NAA>IBA>IAA。

細胞分裂素類則有促進細胞的分裂與分化，延遲組織的衰老，促進芽的產生等作用。常用的有Zip、KT（氯吡脲）、6-BA（6-苄氨基腺嘌呤）、ZT（玉米素）等作用強弱順序為。Zip>KT>6-BA>ZT。

赤霉素則有促進已分化的芽伸長生長，打破種子休眠的作用。常用的為GA3。

組織培養按培養對象可分為組織或愈傷培養、器官培養、植株培養、細胞和原生質體培養等。

1．組織或愈傷組織培養（tissue,callus culture）為狹義的組織培養，是對植物體的各部分組織進行培養，如莖尖分生組織、形成層、木質部、韌皮部、表皮組織、胚乳組織和薄壁組織等等；或對由植物器官培養產生的愈傷組織進行培養，二者均通過再分化誘導形成植株。

2．器官培養（organ culture）即離體器官的培養，根據作物和需要的不同，可以包括分離莖尖、莖段、根尖、葉片、葉原基、子葉、花瓣、雄蕊、雌蕊、胚珠、胚、子房、果實等外植體的培養

3．植株培養（plant culture）是對完整植株材料的培養，如幼苗及較大植株的培養。

4．細胞培養（cell culture）是對由愈傷組織等進行液體振蕩培養所得到的能保持較好分散性的離體單細胞或花粉單細胞或很小的細胞團的培養。

5．原生質體培養（protoplast culture）是用酶及物理方法除去細胞壁的原生質體的培養。

組織培養是本世紀發展起來的一門新技術，由於科學技術的進步，尤其是外源激素的應用，使組織培養不僅從理論上為相關學科提出了可靠的實驗證據，而且一躍成為一種大規模、批量工廠化生產種苗的新方法，並在生產上越來越得到廣泛的應用。

植物組織培養之所以發展如此之快，應用的範圍如此之廣泛，是由於具備以下幾個特點：

1. 培養條件可以人為控制

組織培養採用的植物材料完全是在人為提供的培養基質和小氣候環境條件下進行生長，擺脫了大自然中四季、晝夜的變化以及災害性氣候的不利影響，且條件均一，對植物生長極為有利，便於穩定地進行周年培養生產。

2.生長周期短，繁殖率高

植物組織培養是由於人為控制培養條件，根據不同植物不同部位的不同要求而提供不同的培養條件，因此生長較快。另外，植株也比較小，往往20-30d為一個周期。所以，雖然植物組織培養需要一定設備及能源消耗，但由於植物材料能按幾何級數繁殖生產，故總體來說成本低廉，且能及時提供規格一致的優質種苗或脫病毒種苗。

3.管理方便，利於工廠化生產和自動化控制

植物組織培養是在一定的場所和環境下，人為提供一定的溫度、光照、濕度、營養、激素等條件，極利於高度集約化和高密度工廠化生產，也利於自動化控制生產。

它是未來農業工廠化育苗的發展方向。它與盆栽、田間栽培等相比省去了中耕除草、澆水施肥、防治病蟲害等一系列繁雜勞動，可以大大節省人力、物力及田間種植所需要的土地。

植物組織培養的研究可以追溯到20世紀初期，根據其發展情況，大體可以分為三個時期。

1．萌芽階段

組織培養技術的蓬勃發展只是近50年的事，但它的整個歷史可以追溯至19世紀末和上世紀初。20世紀初，在Schleiden和Schwann所發展起來的細胞學說的推動下，1902年德國植物學家Haberlandt提出了高等植物的器官和組織為許多細胞組成的觀點，以及植物細胞全能性的理論，即植物的體細胞，在適當的條件下，具有不斷分裂和繁殖，發育成完整植株的潛在能力。

他首次發表了植物離體細胞培養實驗的報告。1912年，Habefiandt的學生Kotte和美國的Robins在根尖培養中獲得了組織培養的成功。Kotte採用了無機鹽、葡萄糖、蛋白腖、天冬醯胺，及添加各種氨基酸的培養基。Robins用含無機鹽、葡萄糖或果糖的瓊脂培養基，培養了長度為1.45～3.75cm的豌豆、玉米和棉花的莖尖，形成了一些缺綠的莖和根。

2．奠基階段

自Haberlandt的實驗之後，直到1934年美國的White由番茄根建立了第一個活躍生長的無性繁殖系，並反覆轉移到新鮮培養基中繼代培養，使根的離體培養實驗獲得了真正的成功，並在以後28年間培養了1600代。

這之後，White又以小麥根尖為材料，研究了光、溫度、通氣、pH值、培養基組成等各種培養條件對生長的影響，並於1937年建立了第一個組織培養的綜合培養基，其成分均為已知化合物，包括3種B族維生素，即吡哆醇、硫胺素和煙酸，該培養基後來被定名為White培養基。

與此同時，Gautherer（1934）在研究山毛柳和黑楊等形成層的組織培養實驗中，提出了B族維生素和生長素對組織培養的重要意義，並於1939年連續培養胡蘿蔔根形成層獲得首次成功。同年，White由煙草種間雜種的瘤組織， Nobecourt由胡蘿蔔均建立了與上述類似的連續生長的組織培養物。

因此，Gautherer，White和Nobecourt一起被譽為組織培養學科的奠基人。我們所用的培養方法和培養基，基本上都是由這三位科學家建立的。後來，White於1943年發表了《植物組織培養手冊》專著，使植物組織培養開始成為一門新興的學科。

3．快速發展和應用階段

40年代Skoog和崔徵在煙草莖切段和髓培養以及器官形成的研究中發現，腺嘌呤或腺苷可以解除培養基中生長素（IAA）對芽形成的抑制作用，而能誘導形成芽，從而明確了腺嘌呤與生長素的比例是控制芽和根形成的主要條件之一。即這一比例高時，產生芽；這一比例低時，則形成根；相等則不分化。在尋找促進細胞分裂的物質過程中，Miller等人於1956年發現了激動素。不久即知道激動素可以代替腺嘌呤促進發芽，並且效果可增加3萬倍。結果上述控制器官分化的激素模式變為激動素與生長素的比例關係。這方面的成功發現，有力地推動了植物組織培養的發展。

1952年；Morel和Martin通過莖尖分生組織的離體培養，從已受病毒侵染的大麗花中首次獲得無病毒植株。1935～1945年Muir把單細胞放在一張鋪在愈傷組織上面的濾紙上培養，使細胞發生了分裂，即實施了看護接種技術，使單細胞培養獲得初步成功。

1960年，Cocking等人用真菌纖維素酶分離植物原生質體獲得成功。1971年，Takebe等在煙草上首次由原生質體獲得了再生植株，這不僅在理論上證明了無壁的原生質體同樣具有全能性，而且在實踐上為外源基因的導入提供了理想的受體材料。80年代中期以來，對禾穀類作物的原生質體培養也相繼告捷，在這方面中國學者做出了重要貢獻。1962年印度Guha等人成功地在毛葉曼陀羅花藥培養中，由花粉誘導得到單倍體植株，從而促進了花藥和花粉培養的研究。

以後相繼在煙草、水稻、小麥、玉米、番茄、辣椒、草莓、蘋果等多種植物培養中獲得成功，其數目達到160多種，其中煙草、水稻和小麥等的花藥育種培養在中國取得了引入注目的成就。

1960年，Morel提出了一個離體無性繁殖蘭花的方法，其繁殖係數極高。由於這一方法有很大的應用價值，很快被蘭花生產者所採用，迅速建立起蘭花工業。1973年Carlson等通過兩個煙草物種之間原生質體融合，獲得了第一個體細胞雜種，Cocking等倡導的原生質體培養和體細胞雜交，研究得到了迅速發展，已經能使矮牽牛和煙草屬的雜種細胞增殖分化生成雜種植株。

在整個植物組織培養發展的歷史中，我國學者做出多方面的貢獻，除了前述的崔徵的研究成效以外，還有1993年李繼侗等關於玉米等植物離體根尖培養的研究工作，以及羅士韋關於幼胚和莖尖培養，李正理關於離體胚的研究培養、王伏雄等關於幼胚的研究培養工作。

組織培養所用的材料非常廣泛，可採取根、莖、葉、花、芽和種子的子葉，有時也利用花粉粒和花藥，其中根尖不易滅菌，一般很少採用。對於木本花卉來說，闊葉樹可在一、二年生的枝條上採集，針葉樹種多採種子內的子葉或胚軸，草本植物多採集莖尖。

在快速繁殖中，最常用的培養材料是莖尖，通常切塊在0.5厘米左右，如果為培養無病毒苗而採用的培養材料通常僅取莖尖的分生組織部分，其長度在0.1毫米以下。

1.先將材料用流水沖洗乾淨，最後一遍用蒸餾水沖洗，再用無菌紗布或吸水紙將材料上的水分吸干，並用消毒刀片切成小塊。

2.在無菌壞境中將材料放入70%灑精中浸泡30－60秒。

3.再將材料移入漂白粉的飽和液或0.1%升汞水中消毒10分鐘。

4.取出後用無菌水沖洗三、四次。

將已消毒的材料，用無菌刀、剪、鑷等，在無菌的環境下，剝去芽的鱗片、嫩枝的外皮和種皮胚乳等，葉片則不需剝皮。然後切成0.2－0.5厘米厚的小片，這就是外植體。在操作中嚴禁用手觸動材料。

1.接種

在無菌壞境下，將切好的外植體立即接在培養基上，每瓶接種4－10個。

2.封口

接種后，瓶、管用無菌藥棉或蓋封口，培養皿用無菌膠帶封口。

3.溫度

培養基大多應保持在25℃左右，但要因花卉種類及材料部位的不同而區別對待。

4.增殖

外植體的增殖是組培的關鍵階段，在新梢等形成後為了擴大繁殖係數，需要繼代培養。把材料分株或切段轉入增殖培養基中，增殖培養基一般在分化培養基上加以改良，以利於增殖率的提高。增殖1個月左右後，可視情況進行再增殖。

5.根的誘導

繼代培養形成的不定芽和側芽等一般沒有根，必須轉到生根培養基上進行生根培養。1個月後即可獲得鍵壯根系。

試管苗從無菌到光、溫、濕穩定的環境進入自然環境，必須進行煉苗。一般移植前，先將培養容器打開，於室內自然光照下放3天，然後取出小苗，用自來水把根繫上的營養基沖洗乾淨，再栽入已準備好的基質中，基質使用前最好消毒。移栽前要適當遮蔭，加強水分管理，保持較高的空氣濕度（相對濕度98%左右），但基質不宜過濕，以防爛苗。

植物組織培養成為生物科學的一個廣闊領域，除了在基礎理論的研究上佔有重要地位以外，還在農業生產中也得到越來越廣泛的應用。

用植物組織培養的方法進行快速繁殖(rapidpropagation)是生產上最有潛力的應用，包括花卉觀賞植物、蔬菜、果樹、大田作物及其他經濟作物。快繁技術不受季節等條件的限制，生長周期短，而且能使不能或很難繁殖的植物進行增殖。

快速繁殖可用下列手段進行：通過莖尖、莖段、鱗莖盤等產生大量腋芽；通過根、葉等器官直接誘導產生不定芽；通過愈傷組織培養誘導產生不定芽。試管快速繁殖應用在下列生產或研究中：(1)繁殖雜交育種中得到的少量雜交種，以及保存自交系、不育系等。(2)繁殖脫毒培養得到的少量無病毒苗。(3)繁殖生產上急需的或種源較少的種苗。由於組織培養周期短，增殖率高及能全年生產等特點，加上培養材料和試管苗的小型化，這就可使有限的空間培養出大量的植物，在短期內培養出大量的幼苗。組織培養突出的優點是“快”，通過這一方法在較短時期內迅速擴大植物的數量，以一個莖尖或一小塊葉片為基數，經組織培養一年內可增殖到10 000～100 000株。

植物在生長過程中幾乎都要遭受到病毒病不同程度的危害，有的種類甚至同時受到數種病毒病的危害，尤其是很多園藝植物靠無性方法來增殖，若蒙受病毒病，代代相傳，越染越重，甚至會造成極嚴重的後果。自從Morell952年發現採用微莖尖培養方法可得到無病毒苗(virus free)后，微莖尖培養就成為解決病毒病危害的重要途徑之一。若再與熱處理相結合，則可提高脫毒培養的效果。對於木本植物，莖尖培養得到的植株難以髮根生長，則可採用莖尖微體嫁接的方法來培育無病毒苗。

組織培養無病毒苗的方法已在很多作物的常規生產上得到應用，如馬鈴薯，甘薯，草莓，蘋果，香石竹，菊花等。而且已有不少地區建立了無病毒苗的生產中心，這對於無病毒苗的培養、鑒定、繁殖、保存、利用和研究，形成了一個規範的系統程序，從而達到了保持園藝植物的優良種性和經濟性狀的目的。

植物組織培養過程中往往存在大量的變異，這種變異稱為體細胞無性系變異。具有如下特點：

1．變異的無方向性：既有有利的變異，也有有害的變異既有形態變異，也有生理變異。

2．變異的普遍性：變異在組織培養中經常發生，出現在組織培養的各個時期。既有數量性狀變異，又有質量性狀變異。既有農藝性狀變異，又有經濟性狀變異；既有表型變異，又有生理變異。與自然變異與輻身誘變相比，體細胞無性系變異廣泛而普遍。且易於獲得純合個體。

3．植物體細胞無性系變異的類型：一類為可遺傳變異，主要是由於遺傳物質的變化引起的（尤以基因突變為主）。另一類是不可遺傳的變異，為生理型變異。往往是由於培養過程中外加的激素及其它化學物質的刺激引起。如葉形、育性等。

4．引起植物體細胞無性系變異的原因：激素的刺激為主要原因。高濃度的GA和IAA，會造成畸形胚的高頻發生，TDZ可使植株產生白化苗或玻璃化植株。2，4-D則使培養細胞發生染色體數量變化。隨培養時間的延長，染色體變異頻率升高，變異的性狀和範圍手擴大。

5．植物體細胞無性系變異的利用價值及途徑：它是一種重要的遺傳變異來源，是一種重要的遺傳資源。對於育種有重要的應用價值。

花藥、花粉的培養在蘋果、柑橘、葡萄、草莓、石刁柏、甜椒、甘藍、天竺葵等約20種園藝植物得到了單倍體植株。在常規育種中為得到純系材料要經過多代自交，而單倍體育種，經染色體加倍后可以迅速獲得純合的二倍體，大大縮短了育種的世代和年限。

用植物組織培養技術保存種質具有以下優點：

（1）在較小的空間內可以保存大量的種質資源。

（2）具有較高的繁殖係數。

（3）避免外界不利氣候及其他栽培因素的影響，可常年進行保存。

（4）不受昆蟲、病毒和其他病原體的影響。

（5）有利於國際間的種質交換與交流。

大多數植物遺傳轉化方法需要通過植物組織培養來進行。