免疫細胞化學技術
免疫細胞化學技術
免疫細胞化學技術是利用特異性抗原抗體結合性質定量檢測化學物質的技術。
免疫組化，是應用免疫學基本原理——抗原抗體反應，即抗原與抗體特異性結合的原理，通過化學反應使標記抗體的顯色劑（熒光素、酶、金屬離子、同位素）顯色來確定組織細胞內抗原（多肽和蛋白質），對其進行定位、定性及定量的研究，稱為免疫組織化學技術(immunohistochemistry)或免疫細胞化學技術(immunocytochemistry)。
· 具有特異性高和親和力強的抗體是實驗成功的首要條件。
– 對抗體的要求：純度高、比活性強；
· 高度特異性抗體的獲得，取決於抗原的純度。
– 對抗原的要求：純度高，免疫原性強，穩定無變化。
· 抗原的概念：凡是在機體內引起體液免疫和(或)細胞免疫反應的物質，稱為抗原。抗原具有兩個方面的特性：
– 免疫原性：引起機體產生抗體和(或)致敏淋細胞的特性；
· 根據抗原是否顯示免疫原性分為：
– 完全抗原：分子量較大，一般在10kDa以上，並具有較複雜的化學組成。
· 半抗原必需與載體結合，才能獲得免疫原性。
– 常用的載體有鑰孔血藍蛋白(keyhole limpet hemocyanin，KLH)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)、卵白蛋白(Ovalbumin，OVA)等。
1、抗體的概念：
– 抗體主要存在於血清內；
– 抗體都是免疫球蛋白，但免疫球蛋白並不一定都是抗體。
· 單克隆抗體：是一個B淋巴細胞克隆分泌的抗體，是應用細胞融合雜交瘤技術免疫動物製備的。
– 特異性強、抗體產量高。
· 多克隆抗體：是將純化后的抗原直接免疫動物后，從動物血中所獲得的免疫血清，是多個B淋巴細胞克隆所產生的抗體混合物。
– 特異性低，會產生抗體的交叉反應。
– 多克隆抗體廣泛應用於石蠟包埋組織切片，可減少假陰性染色機會。
– 抗原與抗體的結合，要求量保持一定比例，當抗原或抗體過量時，是不能聚合成大顆粒。
3、抗體的製備——多克隆抗體的製備
· 動物的選擇
· 佐劑(adjuvant)
· 免疫方法
· 免疫劑量
· 抗體效價的測定
· 放血或定期抽血
(1) 動物的選擇
選擇什麼動物來免疫取決於：
· 所需抗血清的量
– 小鼠只能提供1.0～1.5ml的血液，而山羊能提供幾升。
· 能供免疫用的抗原量
– 小鼠50g足夠，而山羊需要幾毫克。
(1) 動物的選擇(續)
· 動物的品系：免疫動物與提供抗原的動物之間的種系差異越大越好。
– 例如哺乳動物的抗原可選擇非哺乳動物來製備抗體。
– 常用的動物有兔、羊、馬、豬等，以兔(紐西蘭兔，年輕，健壯，體重在2.5kg左右，雄性)為最常用。
(2) 佐劑 (adjuvant)
· 最常用的佐劑是弗氏佐劑，又分為:
– 弗氏不完全佐劑(Freund's incomplete adjuvant)
– 弗氏完全佐劑(Freund's complete adjuvant)
弗氏不完全佐劑
(Freund's incomplete adjuvant, FIA)
· 是由油劑(石蠟油或植物油)與乳化劑(羊毛脂或Tween80)混合而成，比例為1:1、2:1、3:1或5:1，可根據需要而定，通常2:1。
· 使用時與水溶性抗原按1:1比例充分混合，使抗原分散在佐劑中形成油包水乳劑。
弗氏完全佐劑 (Freund's complete adjuvant, FCA)
· 在弗氏不完全佐劑中加入活卡介苗或死的結核分枝桿菌(終濃度為2～20mg/ml)，即成為FCA。
· 免疫動物時，將弗氏佐劑與抗原按體積 1:1 混合乳化后(油包水)注入動物。
– 一般首次注射時用完全佐劑乳化，第二次或第三次注射時用不完全佐劑或不用佐劑。
佐劑與抗原乳化的方法
· 研磨法：適於製備大量的佐劑抗原
– 先將不完全佐劑加熱，取1.73ml放人無菌玻璃研缽內；緩緩滴入0.23ml活卡介苗，邊滴邊按同一方向研磨，使菌體完全分散。
– 按同樣方法滴人抗原，每加一滴應研磨至小滴消失。滴加抗原的速度要慢，待抗原全部加人後，應成為乳白色粘稠的油包水乳劑。
· 缺點：研缽壁上粘附大量乳劑，抗原損失較大，對微量或難得抗原不宜採用。
佐劑與抗原乳化的方法(續)
· 注射器混合法
– 將等量的完全佐劑和抗原分別吸人兩個5ml注射器內，然後插入三通管內，交替推動針管混勻，往複操作直至形成粘稠的乳劑為止。
· 優點：無菌操作，節省抗原或佐劑。
· 缺點：不易乳化，時間長。
佐劑與抗原乳化的方法(續)
· 快速乳化法：利用超聲波粉碎器可快速乳化抗原和佐劑混合物。
– 將抗原和佐劑按所需量加入一離心管中，置於超聲波粉碎器上，粉碎頭浸入液面下 0.5cm，離瓶底0.5cm左右，以免打碎離心管。
– 每次乳化 10～15s，然後置冰箱lmin左右。反覆乳化3～4次即可完全乳化。管內殘餘量800r/min離心5～10min收集。
· 優點：簡單、快速、節省材料。
乳化劑的鑒定
· 判斷乳化是否充分，可將一滴乳化好的液體滴在水面上(冷水中)，如能長時間保持圓珠形而不散開，表示乳化達到要求。
(3) 免疫方法——免疫途徑
· 一般採用多點注射方法
– 常在足、掌、腋窩淋巴結周圍、背部兩側、頜下、耳後等處的皮內或皮下。
– 皮內易引起細胞免疫反應，有利於提高抗體的效價。
(3) 免疫方法——免疫途徑 (續)
· 幾點說明：
– 大動物一般不用腹腔注射
– 顆粒抗原和使用佐劑時不能靜脈注射
– 抗原寶貴可採用淋巴結內微量注射法，只需10～100g抗原即可獲得較好的免疫效果。
– 皮內注射較困難，特別是天冷時更難注入。
(3) 免疫方法——次數及間隔時間
· 次數一般為2～3次(初次免疫和加強免疫)
– 首次注射后，10～15天再加強注射；
– 劑量同首次或為首次的一半，用不全佐劑或不用佐劑。
· 間隔時間，一般而言，動物越大，間隔越長
– 第三次注射的間隔時間更長些，效果更好。
舉例1：家兔的免疫
· 初次免疫
– 用50～200g Ag加入FCA，在背部皮下注射6～8點，每點0.1～0.2ml，也可肌肉內或皮內注射；
· 兩周后，加強免疫
– 將50～200g Ag於PBS或FIA中，在肌肉、皮下、靜脈或腹腔內注射；
· 抗體效價的檢測：加強免疫一周后，耳緣靜脈采血
舉例2：微量抗原淋巴結內注射免疫家兔
· 一般選擇2.5～3.0kg的紐西蘭種公兔
– 先在其兩腳墊注射完全福氏佐劑0.2ml(卡介苗每兔合5mg)；
– 10天後，見胭窩淋巴結腫大，然後將抗原注射至腫大的淋巴結內，第一次注射抗原用完全福氏佐劑混合乳化；
– 以後每隔20天用不完全福氏佐劑乳化抗原，以同樣方法加強2次，各次注射的抗原均為25～50g；
– 末次注射兩周后兔耳放血測價 (可達1:128)。
舉例3：豚鼠和大鼠的免疫
· 初次免疫
– 用10～100g Ag加入FCA，在背部皮內注射4～6點，每點 0.lml，也可肌肉內或皮下注射；
· 加強免疫
– 每隔 7～8天，將10～50g Ag於 PBS或FIA中。在肌肉、皮下或靜脈注射；
· 抗體效價的檢測
(4) 免疫劑量
· 免疫周期長的動物可少量多次注射，短的可大量少次。
(4) 免疫劑量 (續)
· 各種動物首次免疫抗原劑量和加強免疫的劑量
(5) 抗體效價的檢測
多采免疫雙向擴散法
【基本原理】
· 指抗原和抗體在同一凝膠內都擴散，彼此相遇后形成特異性的沉澱線。
– 將抗原與抗體分別加入同一凝膠板中兩個相隔一定間距的小孔內，使兩者進行相互擴散，當抗原抗體濃度之比相適宜時，彼此相遇形成一白色弧狀沉澱線。
· 優缺點：簡便，但敏感性較低，易出現假陰性結果。
免疫雙向擴散法的操作步驟
· 將玻璃板用水洗凈後用75%乙醇沖洗，晾乾後放在水平台上備用。
· 將l % agar 融化后，置56C水浴。
· 在玻璃板上鋪膠，約1.5mm 厚，凝固后打孔(直徑 3rnm)，孔間距10mm。
· 中心孔加5l 抗原樣品，周圍孔內每孔加5l 抗血清(抗體預先作系列倍比稀釋即 1:2、1:4、1:8、1:16、1:32等比例)。
· 凝膠板置濕盒內，室溫擴散24h。
· 觀察結果。
抗體效價檢測的其它方法
· 環狀沉澱試驗，需較多的抗血清，現已很少用；
· 對流免疫電泳，比瓊脂免疫雙擴散法敏感，較簡便、實用；
· 酶聯免疫吸附試驗 (ELISA)。
(6) 放血或定期抽血
常用以下3種方法
· 頸動脈放血法：放血量較多，動物不易中途死亡。例如：2.5kg白兔可放血約80ml。家兔、山羊、綿羊等動物采血常用此法。
· 心臟采血法：常用於家兔、豚鼠、大白鼠、雞等小動物，但操作不當易引起動物死亡。
· 靜脈采血：家兔可用耳緣靜脈采血；山羊、綿羊、馬和驢可用頸靜脈采血，這种放血法可隔日1次，有時可採集多量血液。
(6) 放血或定期抽血 (續)
· 采血過程中，動作要輕柔，盡量避免溶血
· 血液凝固后，及時離心收集血清，否則細胞溶解釋放的雜蛋白(例如蛋白水解酶)將污染抗體並將抗體水解，降低效價；
· 標本製備恰當，是免疫組化成功的首要條件
· 免疫組化對組織和細胞標本的要求
– 保持所檢標本原有的結構、形態；
– 在原位最大程度地保持待測抗原(或抗體)的免疫活性，既不淬滅、流失或彌散，也不被隱蔽。
· 免疫組化的組織和細胞標本，製作流程與常規處理方法基本相同，但對組織、細胞的處理又有其特殊要求及注意事項。
– 各種抗原由於其含量及特性的差異對標本處理方式常有不同要求，因此要選擇適用於本實驗的最佳方法。
免疫組化中常用的組織和細胞標本
· 組織標本
– 石蠟切片
– 冰凍切片
· 細胞標本
– 組織印片
– 細胞培養片(細胞爬片)
– 細胞塗片
· 石蠟切片是製作組織標本最常用、最基本的方法
– 最大優點是組織形態保存好，且能作連續切片，有利於各種染色對照觀察；
– 石蠟塊還能長期存檔，供回顧研究。
· 石蠟切片製作過程對組織內抗原顯現有一定的影響，但可通過某些措施予以改善，因而它是大多數免疫組化中首選的組織標本製作方法。
1、取材的特殊要求及注意事項
· 標本新鮮：一般在2h以內進行，超過2h，組織將有不同程度的自溶，其抗原或變性消失，或嚴重彌散。
· 取材部位：除取病灶或含待檢抗原部位外，還應取病灶與正常交界處，即所取組織切片中同時應有抗原陽性和陰性區，以形成自身對照。
– 細胞壞死后，不僅抗原彌散或消失，而且常引起非特異著色，干擾觀察，因此取材時應儘可能避開壞死區。
1、取材的特殊要求及注意事項(續)
· 避免擠壓：取材時組織受擠壓可使邊緣部細胞形態改變並加深非特異著色，因而取材時應使用鋒利的刀刃；
– 鑷取組織動作要輕；
– 經窺鏡直接鉗取的組織往往有過度擠壓，觀察結果時應有所考慮。
2、固定及常用的固定液
· 取材后的組織需立刻投於固定劑中
– 固定使組織和細胞的蛋白質凝固，終止內源性或外源性酶反應，防止組織自溶或異溶，以保持原有結構和形態；
– 對免疫組化而言更有原位保存抗原的作用，避免抗原失活或彌散。
– 醇類（常用乙醇）
– 其它（丙酮）
(1) 醛類
· 甲醛(福爾馬林)應用最廣
– 原理：形成分子間的交聯，影響蛋白構型而使之固定。
– 優點：形態結構保存好，且穿透性強，組織收縮少。
– 缺點：
· 分子間交聯形成的網格結構可能部分或完全掩蓋某些抗原決定簇，使之不能充分暴露。可造成假陰性的染色結果。
– 注意事項：
· 縮短固定時間，降低固定溫度(4C)，為此組織塊不宜過厚。
· 固定后充分水洗以減少分子間交聯。
· 切片在作免疫組化染色前，先經預處理使抗原再現(抗原修復)。
· 戊二醛：
– 穿透性強，微細結構保存好，但對抗原有一定影響，常與其他固定劑聯合用作免疫電鏡固定液。
· 多聚甲醛(常用4%)：
– 可用於免疫電鏡；也可用於免疫熒光染色。
(2) 醇類
· 最常用的醇類固定劑是乙醇。
– 其固定作用：使細胞內蛋白、糖類發生沉澱。
– 優點：穿透性強、抗原性保存好。
– 缺點：
· 脫水性強，易引起組織收縮、變硬，影響切片質量，因而乙醇固定時間不宜過長(2h內)。
· 乙醇使蛋白變性的作用輕，固定后可再溶解；染色過程中，溫育時間長，抗原可流失而減弱反應強度。
(3) 其它固定劑
· 丙酮：
– 對抗原性的保存好，但脫水性更強，較少 用於組織標本，但細胞爬片常用丙酮固定。
3、抗原修復——原因
· 常規的石蠟切片標本均用甲醛固定，結果使得：
– 抗原性物質形成醛鍵、羧甲鍵而被封閉了部分抗原決定簇；
– 蛋白之間發生交聯而使抗原決定簇隱蔽。
· 要求：在染色時，需要先進行抗原修復或暴露，即將固定時分子之間所形成的交聯破壞，而恢復抗原的原有空間形態。
3、抗原修復——方法
· 化學方法
· 加熱方法
– 水浴加熱法
– 微波照射法
– 高壓加熱法
– 酸水解法
(1) 化學方法
– 胰蛋白酶：一般使用濃度為0.05%～0.1%，消化時間為37C，10～40min，主要用於細胞內抗原的顯示；
– 胃蛋白酶：一般使用濃度為0.1%～0.4%，消化時間為37C、30～180min，主要用於細胞間質抗原的顯示。
· 例如：Laminin、CollagenIV
(2) 水浴加熱法
· 將玻片放入裝有抗原修復液的容器中，加熱至沸騰，持續10～15分鐘。
– 優點：操作簡單、經濟，適用於所有的實驗室，
– 缺點：對封閉牢固的抗原決定簇暴露不理想。
(3) 微波照射法
· 將玻片放入裝有抗原修復液的容器中，置微波爐加熱至95℃以上，持續l0～15分鐘，冷卻后，按免疫組化染色步驟進行。
(4) 高壓加熱法暴露抗原
· 將玻片浸入抗原修復液內，置高壓鍋中高壓2～3min，可取得極好的效果。
· 由於高壓下受熱均勻，特別使用於大批量標本的染色。
(1) 酸水解法
· 酸水解可使交聯斷裂、暴露抗原。
· 將玻片浸入1mol/L HCl 溶液中，室溫作用20min(溫度升高，作用時間縮短)。
· 此法能增強特異性染色，降低背景，但需注意水解過度將破壞抗原性及形態結構。
加熱法的注意事項
· 達到規定的溫度(92～95C以上)；
· 維持一定的時間；
· 避免切片乾涸 (抗原可能完全丟失)；
· 加熱后必須經過室溫自然冷卻20～30分鐘，使未摺疊的蛋白分子鏈恢復天然構型；
· 修復液：
– 最常用的是pH6.0的0.01mol/L的枸櫞酸鹽緩衝液；
– 最新研究表明鹼性修復液更有效，推薦使用1mM的EDTA緩衝液(pH8.0)。
4、載玻片的處理
· 抗原修復過程中，由於高溫、高壓等諸多固素的影響，極易造成脫片。為防止脫片，常用粘附劑處理載玻片。
· 常用的粘附劑有：
– APES（3-氨丙基三乙氧基硅烷）
– Polv-L-Lysine（多聚賴氨酸）
– 鉻明膠溶液
APES(3-aminopropyltriethoxysilane)
3-氨丙基三乙氧基硅烷
· 現用現配。用純丙酮或甲醇配製2%APES(v/v);
· 將洗凈的玻片浸於此液中20～30秒鐘；
· 取出稍停片刻，再入純丙酮酮溶液洗去未結合的APES，置通風櫥中晾乾或60C烤箱烤乾。
Polv-L-Lysine (多聚賴氨酸)
· 將清潔玻片浸於100g/ml(10%w/v)的多聚賴氨酸溶液中(去離子水稀釋)，37C放置30min，然後60C烤箱烘烤1h或室溫過夜乾燥。裝盒備用。
鉻明膠溶液
· 試劑：鉻明礬(chrome alum) 0.25g
明膠(gelatine) 2.5g
蒸餾水 500ml
· 先將鉻明礬溶解於40C少量蒸餾水中，再加入明膠及蒸餾水，可在70 C水浴中使明膠溶化，攪拌均勻后，即可使用。如有殘渣，可過濾后再用。
· 用時稍加溶化，切片浸入2～3min，過夜晾乾。
· 冰凍切片是指將組織在冷凍狀態下直接切片。
· 在切片前組織不經過任何化學藥品處理或加熱過程。
– 縮短了製片時間
– 抗原性不受損失
· 對穩定性差的抗原，如淋巴細胞表面抗原尤其適合。
· 組織凍結過程中，細胞內、外的水分會形成冰晶，凍結的速度愈慢，冰晶顆粒愈大，可嚴重影響組織、細胞的形態結構。因此製備凍塊時要求低溫、速凍。
1、冰凍組織塊的常用方法
· 液氮中冰凍：組織投入液氮中 (一196C)中10～20sec；
– 製成凍塊后若需保存，應以鋁箔或塑料薄膜封包，貯存於-70 C冰箱。
2、切片
· 供免疫組化用的冰凍切片同樣要求附貼平整，並有連續性。
· 載玻片也應清潔無油污，但一般無需塗抹粘附劑；
· 切片時，使用恆溫冷凍切片機，在箱內溫度-25 C 。切片厚度一般為4～8m。
3、切片后處理
· 切好的冰凍切片，室溫下自然晾乾1～2h后，入4C丙酮固定10min，待乾燥後作免疫組化染色或封存於-20℃。
· 冰凍切片由於切片技術要求較高，不易得到連續性很好的切片，其形態結構亦不如石蠟片，且凍塊和切片不便於長期貯存，因此冰凍切片的應用受限。
· 將潔凈載玻片輕壓於已暴露病灶的新鮮組織切面，細胞即粘附於玻片，晾乾后浸入冷丙酮或醋酸-乙醇固定10min，自然乾燥后染片或-20℃保存。
· 貼壁細胞培養時，置蓋片於培養瓶中，使細胞在蓋片上生長，達適當密度后取出固定(丙酮-20C固定10～20min)，再進行免疫染色。
– 蓋片的處理方法同載玻片的處理，但泡酸時間2h即可。
– 為了防止細胞脫片，可用多聚賴氨酸處理。
· 大多數細胞塗片由細胞懸液製成，包括：
– 血液、尿液、腦脊液；
– 體腔積液；
– 組織穿刺吸取，如骨髓、淋巴結或其他實質性組織
– 懸浮培養的細胞或貼壁細胞經消化后形成的懸液。
· 細胞塗片的方法：
– 手塗法
· 將細胞濃度調節到106/ml左右，可直接塗於載玻片上，但要均勻、不重疊。
· 圖片範圍應小於1cm直徑，以節約試劑。
– 塗片機塗片法
· 將細胞樣品製成2×105～6/ml 細胞懸液，吸取50～100l (1～2×104～5cells) 加入塗片機內，1000rpm離心2min后細胞就均勻分佈於玻片上。
【原理】
· 用於免疫熒光的標記物是小分子的熒光素，可標記抗體或抗原；
· 藉助於熒光顯微鏡進行觀察。
1、常用的熒光素
· (1) 異硫氰酸熒光素 (Fluorescein Isothiocyanate, FITC)
· (2) 四甲基異硫氰酸羅丹明 (Tetramethyl Rhodamine Isothiocyanate, TRITC)
· (3) 四乙基羅丹明 (RB200)
· (4) 碘化丙啶 (propidium iodide, PI)
(1) 異硫氰酸熒光素(FITC)
· 易溶於水和乙醇。
(2) 四甲基異硫氰酸羅丹明(TRITC)
· 最大吸收光譜550nm，最大發射光譜620nm，呈紅色熒光，分子量為444。
· 與蛋白質結合的方式同FITC。
(3) 四乙基羅丹明(RB200)
· 不溶於水，易溶於乙醇和丙酮。
· 最大吸收光譜為570nm，最大發射光譜為595～600nm，呈橙紅色熒光，分子量為580。
(4) 碘化丙啶(PI)
· 是常用的DNA熒游標記探針，可作為FITC的胞核對比染色。
· 最大吸收光譜是493nm，最大發射光譜是630nm，呈紅色熒光。
2、熒光抗體的保存
· 一要防止抗體失活，二要保持熒光素不脫落和不受激發猝滅。
– 一般認為0～4C可保存1～2年，-20C可保存3～4年。
– 要小量分裝，防止反覆凍融。
– 保存前需加防腐劑 (濃度為1:5000～10000的硫柳汞或1:1000～5000疊氮化鈉) 。
3、免疫熒光的染色方法
· 免疫熒光染色法常用的有
– 直接法
– 間接法
原理：將熒光素標記在相應的抗體上，直接與相應抗原反應 (用來檢測未知抗原)。
直接免疫熒光法的操作步驟
· 標本的處理：
– 細胞塗片、細胞爬片浸入冷丙酮或4%的多聚甲醛固定10min，然後用0.0lM PBST (含0.l%TritonX-100 pH 7.4) 漂洗5min × 3/次；
– 石蠟切片經脫蠟、梯度酒精脫水后，進行抗原修復，然後用0.01M PBST漂洗5min × 3/次；
· 2%BSA或10%BSA37C濕盒內封閉30min
· 抗體染色：
– 在標本片上滴加適當稀釋的熒游標記抗體(1:8或1:16稀釋)，放在濕盒中，37C孵育30min；
直接免疫熒光法的操作步驟(續)
· 0.0lmol/L PBS(pH 7.4) 漂洗5min × 3/次，不時震蕩(洗去多餘遊離的熒光素標記的抗體)。
· 緩衝甘油封片
– 分析純無熒光的甘油9份+ pH 9.2，0.2M碳酸鹽緩衝液1份配製。
· 鏡檢：在熒光顯微鏡下觀察。
· 優點：方法簡便、特異性高，非特異性熒光染色少。
· 缺點：敏感性偏低；而且每檢查一種抗原就需要製備一種熒光抗體。若檢測多種抗原需製備多種相應的熒游標記抗體。
直接免疫熒光法的注意事項
· 對熒游標記的抗體的稀釋：要保證抗體的蛋白有一定的濃度；
· 一般稀釋度不應超過1:20，抗體濃度過低，會導致產生的熒光過弱，影響結果的觀察。
直接免疫熒光法的注意事項 (續)
· 染色溫度和時間需要根據各種不同的標本及抗原而變化；
– 染色時間：從10 min到數小時，一般30 min；
– 染色溫度：多採用室溫(25C)，高於37C可加強染色效果，但對不耐熱的抗原(如流行性乙型腦炎病毒)可採用0-2C的低溫，延長染色時間。
– 低溫染色過夜較37 C 30 min效果好的多。
直接免疫熒光法的注意事項 (續)
· 試驗時需設置下列對照：
– 陽性對照：用已知的陽性標本加熒游標記的特異性抗體。
– 特異性對照(抑制試驗)：標本加未標記的特異性抗體，再加熒游標記的特異性抗體。
· 若標本自發熒光對照和特異性對照呈無熒光或弱熒光，陽性對照和待檢標本呈強熒光，則為特異性陽性染色。
直接免疫熒光法的注意事項 (續)
· 一般標本在高壓汞燈下照射超過3min，就有熒光減弱現象；
· 經熒光染色的標本最好在當天觀察，隨著時間的延長，熒光強度會逐漸下降。
(2) 間接法又稱為熒光抗-抗體法
– 可用來檢測標本中未知抗原，也可檢測血清中未知抗體。
間接免疫熒光法操作步驟
· 標本的處理及非特異染色的封閉同直接法；
· 一抗染色：
– 加未標記的特異性抗體(通常1:100稀釋，用0.01MpH7.4的PBS稀釋)，37C作用30min或4C過夜。
· 0.01M PBST漂洗5min×3次(震蕩漂洗)；
間接免疫熒光法操作步驟(續)
· 加熒游標記的二抗抗體，37C濕盒避光作用30min。
· 0.01M PBST避光漂洗5min×3次(例如包上錫紙，在搖床上漂洗)；
· 甘油緩衝液封片
· 鏡檢
· 優點：敏感性較高，比直接法高10倍左右；製備一種熒游標記抗體，可應用於多種一抗；
· 缺點：是參加反應的因子較多，產生非特異性染色的機會增多。
間接免疫熒光法的注意事項
· 熒光染色后一般在1h內完成觀察，或於4℃保存4h，時間過長，會使熒光減弱。
· 每次試驗時，需設置以下三種對照：
– 陽性對照：陽性血清+熒游標記物
– 陰性對照：陰性血清+熒游標記物
– 熒游標記物對照：PBS+熒游標記物
間接免疫熒光法的注意事項(續)
· 標本片需在操作的各個步驟中，始終保持濕潤，避免乾燥。
· 一抗和二抗應始終保持在標本片上，避免因放置不平使液體流失，從而造成非特異性熒光染色。
【原理】
· 以酶作為標記物與外加底物作用后產生不溶性色素，沉積於抗原和抗體反應的部位；
· 酶降解底物的量與色澤濃度成正比。可反映被測定的抗原或抗體的量。
1、常用的標記酶及其顯色底物
· 鹼性磷酸酶(alkaline phosphatase, AP)及底物
(1) 辣根過氧化物酶(HRP)及底物
· 底物為過氧化物和供氫體(DH2)
– 過氧化物：常用過氧化氫和過氧化氫尿素。
– 供氫體：多用無色的還原型染料，通過反應生成有色的氧化 型染料，最常用的供氫體是DAB。
DAB (二氨基聯苯胺)
· DAB本身無色，反應后呈棕色，不溶於水，不易褪色，電子密度高，最為常用。
· 目前已經有商品化的試劑盒，使用起來非常方便。
(2) 鹼性磷酸酶(AP)及底物
· AP為磷酸酯的水解酶，可通過兩種反應顯色：
– 偶氮偶聯反應，底物為-萘酚磷酸鹽，經水解后得-萘酚，與重氮化合物如堅牢藍(fast blue)或堅牢紅(fast red)形成不溶性沉澱，分別呈蘭色或紅色。
– 靛藍-四唑反應：底物為溴氯羥吲哚磷酸鹽(5-bromo-4-chloro-3-indodyl phosphate,BCIP)，經酶水解並氧化形成靛藍，而氮藍四唑(NBT)在此氧化過程中被還原成不溶性紫蘭色沉澱。
2、常用的免疫酶染色方法
· 又分為以下兩種方法：
– 酶標抗體法
· 直接法
· 間接法
– 非標記抗體酶法
· 酶橋法
· PAP法
(1) 酶標抗體法
· 通過共價鍵將酶結合在抗體上，製成酶標抗體，與標本進行反應后，再用酶組化法將酶顯色，使之生成有色的不溶性產物或具有一定電子密度的顆粒，以供光鏡和電鏡觀察。
– 優點：切片能長期保存、反覆觀察，適於鏡下半定量分析。
– 缺點：酶與抗體形成的共價鍵，可損害抗體和酶的活性；易產生非特異染色。
(1) 酶標抗體法——直接法
· 將酶直接標記在一抗上，然後直接與相應抗原特異地結合。形成抗原-抗體-酶複合物，最後用底物顯色劑顯色。
(1) 酶標抗體法——間接法
· 將酶標記在二抗上，先將一抗與相應的抗原結合，形成抗原抗體複合物，再用二抗(酶標抗體)與複合物中的特異抗體結合，形成抗原-抗體-酶標抗體複合物，最後用底物顯色劑顯色。
酶標抗體間接法的操作步驟
· 標本準備：
– 石蠟脫蠟至水；
– 冰凍切片浸入4C丙酮固定10min，0.01M PBST漂洗，5min×3；
– 細胞爬片先用PBS洗，然後4C丙酮固定10min，再0.01M PBST漂洗，5min×3；
· 石蠟切片需要進行抗原修復，其它標本則不用；
(2) 酶標抗體間接法的操作步驟(續)
· 封閉內源性過氧化物酶：3%H2O2-甲醇溶液室溫孵育5～10min (濕盒內) ；
· 0.01M PBST漂洗，5min×3；
· 5～10%正常山羊血清(0.01M PBS稀釋)封閉，室溫孵育30min (濕盒內) ；
· 傾去血清勿洗，加1%BSA(PBST配製)稀釋的一抗， 37C孵育60min 或4C過夜(濕盒內)；
(2) 酶標抗體間接法的操作步驟(續)
· 0.01M PBST漂洗，5min×3；
· 加HRP標記的二抗室溫孵育lh或37C 30min ；
· 加0.01%H2O2~0.05%DAB顯色 (顯色液應新鮮配置)；
(2) 非標記抗體酶法——酶橋法
· 首先用酶免疫動物，製備效價高、特異性強的抗酶抗體；
· 以二抗作橋，將抗酶抗體聯結在一抗上；
· 再將酶結合在抗酶抗體上，經顯色顯示抗原的分佈
– 優點：任何抗體均未被酶標記。酶是通過免疫學原理與酶抗體結合的。避免了共價連接對抗體和酶活性的損害，提高了方法的敏感性，而且節省一抗的用量。但抗酶抗體不易純化。
幾點說明
· 一抗(假設來自種屬A)的稀釋度可大些，使抗體的兩個Fab段均與組織抗原結合。
· 二抗——橋抗體(抗種屬A的IgG抗體)應過量，使其Fab段一個與一抗結合，另一個則遊離。
· 因抗酶抗體與一抗均系種屬A IgG，具有相同的抗原性，所以橋抗體遊離的Fab能與抗酶抗體結合，起橋作用，將其連接在與組織抗原結合的一抗上。
(2) 非標記抗體酶法——PAP法
· 與酶橋法相似，不同的是，PAP法將酶橋法的第3、4步並為1步，用PAP複合物代替;
· PAP是離體製備的複合物(HRP--抗HRP)。
· 顯色與酶橋法相同，PAP複合物中的過氧化物酶催化底物水解，形成不溶性終產物。
PAP法評價
· PAP法比直接法、間接法、酶橋法更敏感。特別適用於石蠟切片中微量抗原和抗原性減弱抗原的檢測。
– 缺點：步驟較多，時間較長，不適用於臨床常規檢查。
· 由於常做石蠟切片，故可用於回顧性研究。
· 是以一種物質對某種組織成分具有高度親合力為基礎。
· 這種方法敏感性更高，有利於微量抗原(抗體)在細胞或亞細胞水平的定位。
生物素—抗生物素染色法
【原理】
· 兩者均可與抗體等大分子生物活性物質相偶聯，又可被酶類等多種示蹤物所標記，形成生物素-抗生物素系統。
(1)標記抗生物素—生物素法(labelled avidin-biotin method, LAB)：分為直接法和間接法。
· 直接法
用生物素標記第一抗體，與抗原結合；酶標記抗生物素，與生物素結合，然後進行酶呈色反應。
· 間接法
用生物素標記二抗，酶標記抗生物素，先用第一抗體與組織抗原結合，再將第二抗體與第一抗體相連結，最後進行呈色反應。
(2)橋抗生物素一生物素法(bridge avidin-biotin method，BRAB)
– 此法是用生物素分別標記抗體和酶，以抗生物素為橋，把二者連接起來，進行呈色反應。
(3) 抗生物素-生物素-過氧化物酶法
(ABC法)
· ABC法是在BRAB和LAB的基礎上改良的方法。
· ABC複合物是將過氧化物酶結合在生物素上，再將其與過量的抗生物素反應而製備的。
· 分為直接法和間接法。
– 直接法是生物素標記的一抗與ABC複合物結合；
– 間接法是生物素標記的二抗與ABC複合物結合。
ABC法的評價
· 敏感性強：ABC法比PAP法敏感性高20~40倍。
· 特異性強，背景染色淡：由於敏感性高，一抗和二抗都可被稀釋至可能的濃度，減少了非特異染色。
· 方法簡便，節約時間。可由PAP法所需的2天縮短至幾個小時。
· 由於生物素與抗生物素具有與多種示蹤物結合的能力，可用於雙重或多重免疫。