實時熒光定量PCR

所謂實時熒光定量PCR技術，是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程，最後通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。

檢測方法

1.SYBRGreenⅠ法：

在PCR反應體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地摻入DNA雙鏈后，發射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產物的增加完全同步。

SYBR定量PCR擴增熒光曲線圖

PCR產物熔解曲線圖（單一峰圖表明PCR擴增產物的單一性）

2.TaqMan探針法：

探針完整時，報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5’-3’外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監測系統可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現了熒光信號的累積與PCR產物的形成完全同步。

技術原理

將標記有熒光素的Taqman探針與模板DNA混合后，完成高溫變性，低溫復性，適溫延伸的熱循環，並遵守聚合酶鏈反應規律，與模板DNA互補配對的Taqman探針被切斷，熒光素遊離於反應體系中，在特定光激發下發出熒光，隨著循環次數的增加，被擴增的目的基因片段呈指數規律增長，通過實時檢測與之對應的隨擴增而變化熒光信號強度，求得Ct值，同時利用數個已知模板濃度的標準品作對照，即可得出待測標本目的基因的拷貝數。

Ct值（Cycle threshold，循環閾值）的含義為：每個反應管內的熒光信號到達設定閾值時所經歷的循環數。

1. 熒光閾值（threshold）的設定

PCR反應的前15個循環的熒光信號作為熒光本底信號，熒光閾值的預設（默認）設置是3-15個循環的熒光信號的標準偏差的10倍，即：threshold = 10*SDcycle 3-15

2. Ct值與起始模板的關係

每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數的對數存在線性關係，公式如下。

Ct=-1/lg(1+Ex)*lgX0+lgN/lg(1+Ex)

n為擴增反應的循環次數，X0為初始模板量，Ex為擴增效率，N為熒光擴增信號達到閾值強度時擴增產物的量。

起始拷貝數越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數的標準品可作出標準曲線，其中橫坐標代表起始拷貝數的對數，縱坐標代Ct值。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數。

熒光化學物質

實時熒光定量PCR所使用的熒光物質可分為兩種：熒光探針和熒光染料。現將其原理簡述如下：

1. TaqMan熒光探針：PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5'－3'外切酶活性將探針酶切降解，實現了熒光信號的累積與PCR產物形成完全同步。而新型TaqMan-MGB探針使該技術既可進行基因定量分析，又可分析基因突變（SNP），有望成為基因診斷和個體化用藥分析的首選技術平台。

2. SYBR熒光染料：在PCR反應體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料非特異性地摻入DNA雙鏈后，SYBR僅與雙鏈DNA進行結合，因此可以通過溶解曲線，確定PCR反應是否特異。

3. 分子信標：是一種在5和3末端自身形成一個8個鹼基左右的髮夾結構的莖環雙標記寡核苷酸探針，兩端的核酸序列互補配對，導致熒光基團與淬滅基團緊緊靠近，不會產生熒光。PCR產物生成后，退火過程中，分子信標中間部分與特定DNA序列配對，熒光基因與淬滅基因分離產生熒光 。

傳統定量PCR

1．傳統定量PCR方法簡介

（1）內參照法：在不同的PCR反應管中加入已定量的內標和引物，內標用基因工程方法合成。上游引物用熒游標記，下游引物不用標記。在模板擴增的同時，內標也被擴增。在PCR產物中，由於內標與靶模板的長度不同，二者的擴增產物可用電泳或高效液相分離開來，分別測定其熒光強度，以內標為對照定量待檢測模板。

（2）競爭法：選擇由突變克隆產生的含有一個新內切位點的外源競爭性模板。在同一反應管中，待測樣品與競爭模板用同一對引物同時擴增（其中一個引物為熒游標記）。擴增後用內切酶消化PCR產物，競爭性模板的產物被酶解為兩個片段，而待測模板不被酶切，可通過電泳或高效液相將兩種產物分開，分別測定熒光強度，根據已知模板推測未知模板的起始拷貝數。

（3）PCR－ELISA法：利用地高辛或生物素等標記引物，擴增產物被固相板上特異的探針所結合，再加入抗地高辛或生物素酶標抗體－辣根過氧化物酶結合物，最終酶使底物顯色。常規的PCR－ELISA法只是定性實驗，若加入內標，作出標準曲線，也可實現定量檢測目的。

2．內標在傳統定量中的作用

由於傳統定量方法都是終點檢測，即PCR到達平台期後進行檢測，而PCR經過對數期擴增到達平台期時，檢測重現性極差。同一個模板在96孔PCR儀上做96次重複實驗，所得結果有很大差異，因此無法直接從終點產物量推算出起始模板量。加入內標后，可部分消除終產物定量所造成的不準確性。但即使如此，傳統的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。

3．內標對定量PCR的影響

若在待測樣品中加入已知起始拷貝數的內標，則PCR反應變為雙重PCR，雙重PCR反應中存在兩種模板之間的干擾和競爭，尤其當兩種模板的起始拷貝數相差比較大時，這種競爭會表現得更為顯著。但由於待測樣品的起始拷貝數是未知的，所以無法加入合適數量的已知模板作為內標。也正是這個原因，傳統定量方法雖然加入內標，但仍然只是一種半定量的方法。

實時熒光定量PCR

實時熒光定量PCR技術有效地解決了傳統定智能能終點檢測的局限，實現了每一輪循環均檢測一次熒光信號的強度，並記錄在電腦軟體之中，通過對每個樣品Ct值的計算，根據標準曲線獲得定量結果。因此，實時熒光定量PCR無需內標是建立在兩個基礎之上的：

（1）Ct值的重現性PCR循環在到達Ct值所在的循環數時，剛剛進入真正的指數擴增期（對數期），此時微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現性極好，即同一模板不同時間擴增或同一時間不同管內擴增，得到的Ct值是恆定的。

（2）Ct值與起始模板的線性關係由於Ct值與起始模板的對數存在線性關係，可利用標準曲線對未知樣品進行定量測定，因此，實時熒光定量PCR是一種採用外標準曲線定量的方法。

外標準曲線的定量方法相比內標法是一種準確的、值得信賴的科學方法。利用外標準曲線的實時熒光定量PCR是迄今為止定量最準確，重現性最好的定量方法，已得到全世界的公認，廣泛用於基因表達研究、轉基因研究，藥物療效考核、病原體檢測等諸多領域。

實時熒光定量PCR的定量方法

在Real-timePCR中，模板定量有兩種策略，相對定量和絕對定量。

臨床疾病診斷

各型肝炎、艾滋病、禽流感、結核、性病等傳染病診斷和療效評價；地中海貧血、血友病、性別發育異常、智力低下綜合症、胎兒畸形等優生優育檢測；腫瘤標誌物及瘤基因檢測實現腫瘤病診斷；遺傳基因檢測實現遺傳病診斷。

動物疾病檢測

禽流感、新城疫、口蹄疫、豬瘟、沙門菌、大腸埃希菌、胸膜肺炎放線桿菌、寄生蟲病等、炭疽芽孢桿菌。

食品安全

食源微生物、食品過敏源、轉基因、乳品企業阪崎腸桿菌等檢測。

科學研究

醫學、農牧、生物相關分子生物學定量研究。

應用行業

各級各類醫療機構、大學及研究所、CDC、檢驗檢疫局、獸醫站、食品企業及乳品廠等。

由於qPCR是實時定量檢測致病病原體基因核酸，因此它比化學發光、時間分辨、蛋白晶元等免疫學方法更具獨到優勢。

根據MIQE（Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments） 的指導方針，qPCR為Quantitative real-time PCR的簡稱，RT-qPCR指的是Reverse transcription–qPCR，RT-PCR僅用來表示Reverse transcription polymerase chain reaction，而不是Real-time PCR，但是有少數作者並沒有堅持這一原則。

2013年春季，中國內地發生多起H7N9禽流感染人人類事件，截至4月6日下午五時，全國共報告18例人類感染，6人死亡。針對此次禽流感事件，對送檢樣本進行H7N9檢測的方法共有兩種，一種是進行核酸檢測，即採用實時熒光定量PCR方法對H7N9的特異性核酸進行檢測；另一種一種就是對樣本進行H7N9病毒分離鑒定，直接獲取毒株。“核酸檢測快速準確，是現在實驗室採用的主要檢驗方法。”專家說，H7N9特異性核酸檢驗耗時短，從完成樣本處理到最後獲取檢測結果，進行確診，整個過程在3-5個小時內完成，可實現對病毒的快速診斷。

檢測過程分為三個步驟：對醫院採集樣本進行標本處理，如果發現可疑病例，將由當地醫院專業的醫護人員進行採樣，主要提取患者的咽拭子樣本或含漱液、鼻拭子、肺部清洗液的樣本，安全保存後送至實驗室開展病毒檢測；提取病毒核酸，隨後與H7N9核酸檢測試劑配成反應體系，因為檢測試劑主要針對H7N9的特異性核酸片段會起反應。可以說，通過這個試劑能快速確定病人是否感染了H7N9禽流感病毒；放入熒光定量PCR儀做病毒核酸特異擴增，進行熒光定量檢測，最後結果進行檢測分析，判斷是否呈陽性反應。

浙江省公共衛生檢驗檢測重點學科群首席專家、應急監測關鍵技術重點實驗室主任盧亦愚教授，介紹了浙江省自行合成H7N9禽流感檢測試劑：

“H7N9禽流感檢測試劑被放置在食指大小的密封透明試管里。每套檢測試劑由6份EP管組成，包含白色的水滴形小管‘引物’，以及棕色小管‘探針’。引物和探針主要是針對H7N9特異性核酸片段。目前這些試劑被放在專用試劑盒中，放置在專用冰箱保存。”

“工作人員需要將檢測的結果，結合實驗時設置的陽性、陰性對照進行分析，只有陰性、陽性結果成立，且樣本結果可靠時才能夠最終確定是否為H7N9禽流感病毒，一般來說，檢測時間需3-4個小時。”