基因擴增技術

PCR技術是由Cetus公司和加利福尼亞大學1985年聯合創造的，主要貢獻者為Kary B mulis和HeneryA、Erlich。該方法首先被應用於人β-珠蛋白DNA的擴增及鐮刀狀紅細胞貧血病的產前診斷。自85年首次報道PCR方法以來，PCR被廣泛應用於分子克隆、序列分析、基因突變、遺傳病、傳染病、性傳播性疾病及法醫判定和考古研究等多領域、併發揮了越來越大的作用。因而發明人Kary B、mulis獲1993年諾貝爾化學獎。

PCR擴增DNA的原理是：先將含有所需擴增分析序列的靶DNA雙鏈經熱變性處理解開為兩個寡聚核苷酸單鏈，然後加入一對根據已知DNA序列由人工合成的與所擴增的DNA兩端鄰近序列互補的寡聚核苷酸片段作為引物，即左右引物。此引物範圍就在包括所欲擴增的DNA片段，一般需20-30個鹼基對，過少則難保持與DNA單鏈的結合。引物與互補DNA結合后，以靶DNA單鏈為模板，經反鏈雜交復性（退火），在Taq DNA聚合酶的作用下以4種三磷酸脫氧核苷（dNTP）為原料按5'到3'方向將引物延伸、自動合成新的DNA鏈、使DNA重新複製成雙鏈。然後又開始第二次循環擴增。

引物在反應中不僅起引導作用，而且起著特異性的限制擴增DNA片段範圍大小的作用。新合成的DNA鏈含有引物的互補序列，並又可作為下一輪聚合反應的模板。如此重複上述DNA模板加熱變性雙鏈解開—引物退火復性—在DNA聚合酶作用下的引物延伸的循環過程，使每次循環延伸的模板又增加1倍，亦即擴增DNA產物增加1倍，經反覆循環，使靶DNA片段指數性擴增。

PCR的擴增倍數Y=（1+E）n,這裡Y是擴增量，n為PCR的循環次數。E為PCR循環擴增效率。設PCR擴增效率E為100%、循環次數n=25次，靶DNA將擴增到33554432個拷貝，即擴增3355萬倍：若E為80%、n=20、則擴增數量將下降到1408865拷貝，即擴增產物約丟失93%，若E=100%，n=20，則擴增數量減少1048576個拷貝，擴增產物約減少97%。可見PCR循環擴增效率及循環次數都對擴增數量有很大影響。

PCR擴增屬於酶促反應，所以，DNA擴增過程遵循酶促動力學原理。靶DNA片段的擴增最初表現為直線上升，隨著靶DNA片段的逐漸積累，當引物—模板/DNA/聚合酶達到一定比值時，酶的促化反應趨於飽和，此時靶DNA產物的濃度不再增加，即出現所謂平台效應。PCR反應達到平台期的時間主要取決於反應開始時樣品中的靶DNA的含量和擴增效率，起始模板量越多到達平台期的時間就越短、擴增效率越高到達平台期的時間也越短。另外酶的含量，dNTp 濃度，非特異性產物的擴增都對到達平台期時間有影響。

首次報導的PCR所用的DNA聚合酶是大腸桿菌的DNAPolymerase I的Klenow大片段，其酶活性在90℃會變性失活，需每次PCR循環都要重新加入Klenow大片段，同時引物是在37℃延伸（聚合）易產生模板—引物之間的鹼基錯配、致特異性較差，1988年Saiki等從溫泉水中分離到的水生嗜熱桿菌中提取的熱穩定的Taq DNA聚合酶，在熱變性處理時不被滅活，不必在每次循環擴增中再加入新酶，可以在較高溫度下連續反應，顯著地提高PCR產物的特異性，序列分析證明其擴增的DNA序列與原模板DNA一致。

擴增過程中，單核苷酸的錯誤參入程度很低、其錯配率一般只有約萬分之一，足可以提供特異性分析，選用各型病毒相對的特異寡核苷酸引物。PCR能一次確定病毒的多重感染。如用HPV11和HPV16型病毒引物檢測病婦宮頸刮片細胞可以發現部分病人存在HPV11和HPV16兩型的雙重感染。

理論上PCR可以按2n倍數擴增DNA十億倍以上，實際應用已證實可以將極微量的靶DNA成百萬倍以上地擴增到足夠檢測分析量的DNA。能從100萬個細胞中檢出一個靶細胞，或對諸如病人口液等只含一個感染細胞的標本或僅含0.01pg的感染細胞的特異性片段樣品中均可檢測。

一般在2小時內約可完成30次以上的循環擴增，加上用電泳分析。只需3-4小時便可完成，不用分離提純病毒，DNA粗製品及總RNA均可作為反應起始物，可直接用臨床標本如血液、體液、尿液、洗液、脫落毛髮、細胞、活體組織等粗製的DNA的提取液來擴增檢測，省去費時繁雜的提純程序，擴增產物用一般電泳分析即可，不一定用同位素，無放射性易於推廣。

擴增產物可直接供作序列分析和分子克隆，擺脫繁瑣的基因方法，可直接從RNA或染色體DNA中或部分DNA已降解的樣品中分離目的基因，省去常規方法中須先進行克隆后再作序列分析的冗繁程序。已固定的和包埋的組織或切片亦可檢測。如在PCR引物端事先構建一個內切酶位點，擴增的靶DNA可直接克隆到M13，PUC19等相應酶切位點的載體中。

先按通常方法用寡脫氧胸苷引物和逆轉錄酶將mRNA轉變成單鏈cDNA，再將得到的單鏈cDNA進行PCR擴增，即使mRNA轉錄片段只有100ngcDNA中的0.01%，也能經PCR擴增1ng有242鹼基對長度的特異片段，有些外顯子分散在一段很長的DNA中，難以將整段DNA大分子擴增和做序列分析。若以mRNA作模板，則可將外顯子集中，用PCR一次便完成對外顯子的擴增並進行序列分析。

（1）引物：決定擴增的特異性。根據檢測的DNA不同，選用不同引物，每種病原微生

物都有自己特異的引物。

（2）耐熱的DNA聚合酶：此酶是從耐熱細菌中分離出來的，能耐受高溫90℃-100℃。

（3）10×PCR緩衝液：500mmol/l KCl;100mmol/L Tris-HCl(pH8.4,20℃)150mmol/L MgCl2,1mg/ml明膠。10×PCR緩衝液隨酶一起購買。

（4）5mmol/L dNTP貯備液：將dATP、dCTP、dGTP和dTTP鈉鹽各100mg合併，加入滅菌去離子水溶解，用NaOH調pH至中性，分裝每份300μl，-20℃保存。dNTP濃度最好用UV吸收法精確測定。現用dNTP溶液均有商品化產品。

（5）DNA模板：用處理液將待測標本處理，不同處理方法、操作各異，但目的是暴露標本中被檢測的DNA。

過去標準的PCR操作程序是將PCR必需反應成份分別加入一微量離心管中，然後置於一定的循環參數條件下進行循環擴增。具體如下：

（1）向一微量離心管中依次加入

DNA模板102-105拷貝

引物各1μmol/L

dNTP各200μmol/L

10×PCR緩衝液1/10體積

ddH2O補到終體積（終體積50μl-100μl）

混勻后，離心15s使反應成分集於管底。以上步驟僅在實驗研究用，現在商品化試劑已將dNTP、10×PCR緩衝液，引物，ddH2O混合在一起，反應體積為20-25μl，只要試驗人員加入處理好的樣品就可以了。

（2）加石蠟油50-100μl於反應液表面以防蒸發。置反應管於97℃變性10min。

（3）冷至延伸溫度時，加入1-5u Taq DNA聚合酶，離心30s使酶和反應液充分混合。現在臨床使用試劑酶通常已加入反應液中。

（4）PCR的循環程序為：94℃變性30s，55℃退火20s，然後在72℃延伸30s，共循環30-35次。最後一次循環結束后，再將反應管置72℃溫育5min，以確保充分延伸。

PCR尚可用於組織標本DNA的擴增。由於固定組織標本的DNA常發生降解，就給常用的分析方法如Southern轉印雜交等帶來一定困難。87年Impraim等人首先將PCR技術引入固定包埋組織內DNA分析。他們先從組織標本中提取DNA，再用PCR進行特異性的DNA擴增，應用這種方法，他們成功地從保存30至40年之久的組織標本DNA中擴增了HPV病毒基因片段。但這種方法需要提取DNA，操作比較繁瑣。1988年Shibata等人對Impraim的方法進行了改進。他們將固定包埋的組織塊製成5-10um厚，0.4cm大小的切片。將切片放入容積為500μl的Eppendorf管內。加入400μl二甲苯脫脂，離心除去二甲苯，用400μl 95%乙醇洗去殘餘二甲苯。離心除盡乙醇、加入100μlPCR反應基質，將Eppendorf管放入沸水浴中煮10min，然後按前述PCR方法進行DNA擴增。

在應用PCR方法檢測RNA病毒時，首先應將RNA轉化成cDNA才能進行擴增，因為PCR只能對DNA模板進行擴增，我們把這種RNA的PCR反應稱為反轉錄PCR，簡稱RT-PCR。把由RNA轉化成DNA的過程叫做反轉錄，反轉錄需要在反轉錄酶的作用下完成。

模板核酸

PCR可以以DNA或RNA為模板進行核酸的體外擴增。不過RNA的擴增首先逆轉錄成cDNA后才能進行PCR循環。不同來源的核酸標本必須經處理后才能用於PCR的擴增，處理不當或處理過程中DNA掉失都會導致PCR擴增失敗。採集標本方法不當，未能獲得所要檢測的靶DNA都會導致出現假陰性。但是如果待擴增標本中模板DNA濃度太高也會導致擴增失敗。

引物

PCR結果的特異性取決於引物的特異性，擴增產物的大小也是由特異引物限定的。因此，引物的設計與合成對PCR的成功與否起著決定性的作用。合成的引物必須經聚丙烯醯胺凝膠電泳或反向高壓液相層析（HPLC）純化。因為合成的引物中會有相當數量的“錯誤序列”，其中包括不完整的序列和脫嘌呤產物以及可檢測到的鹼基修飾的完整鏈和高分子量產物。這些序列可導致非特異擴增和信號強度的降低。因此，PCR所用引物質量要高，且需純化。凍干引物於-20℃至少保存12-24個月，液體狀態於-20℃可保存6個月。引物不用時應存於-20℃保存。

PCR反應中引物的量也影響PCR擴增效果，當PCR引物量太低，則產物量降低，會出現假陰性。引物濃度過高會促進引物的錯誤引導非特異產物合成，還會增加引物二聚體的形成。非特異產物和引物二聚體也是PCR反應的底物，與靶序列競爭DNA聚合酶，dNTP底物，從而使靶序列的擴增量降低。一般認為PCR反應中引物的終濃度為0.2～1μmol/L為宜，但我們實驗發現，最適濃度遠遠低於此濃度。

PCR反應的緩衝液的目的是給Taq DNA聚合酶提供一個最適酶催反應條件。目前最為常用的緩衝體系為10-50mmol/L　Tris-HCl (pH8.3-8.8,20℃) Tris是一種雙極性離子緩衝液，20℃時其pKa值為8.3，△pKa值為-0.021/℃。因此，20mmol/l Tris-HCl(pH8.3,20℃)在實際PCR中，pH變化於6.8-7.8之間。改變反應液的緩衝能力，如將Tris濃度加大到50mmol/L，pH8.9,有時會增加產量。

反應混合液中50mmol/L以內的KCl，pH8.9有利於引物的退火，50mmol/l NaCl或50 mmol/L以上的KCl則抑制Taq DNA聚合酶的活性。有些反應液中以NH+4代K+，其濃度為16.6mmol/L。反應中加入小牛血清白蛋白（100μg/ml）或明膠（0.01%）或Tween 20（0.05% ～0.1%）有助於酶的穩定，反應中加入5mmol/l 的二硫蘇糖醇（DTT）也有類似作用，尤其在擴增長片段（此時延伸時間長）時，加入這些酶保護劑對PCR反應是有利的。

Mg2+

Mg2+濃度直接影響著酶的活性與忠實性，這是Taq DNA聚合酶活性所必需的。另外它還影響著引物的退火，模板與PCR產物的解鏈溫度，產物的特異性，引物二聚體的形成等。Mg2+濃度過低時，酶活力顯著降低；過高時，通常會導致非特異性擴增產物的累積。PCR混合物中的DNA模板，引物和dNTp 的磷酸基團均可與Mg2+結合，降低Mg2+實際濃度。因為Taq DNA聚合酶需要的是遊離Mg2+。

三磷酸脫氧核苷酸

四種脫氧核苷三磷酸（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）是DNA合成的基本原料，PCR反應中dNTP含量太低，PCR擴增產量太少、易出現假陰性。過高的dNTP濃度會導致聚合將其錯誤摻入（即所謂的“熱力背信”），因此應當避免。一般認為最適的dNTP濃度為50～200μmol/L。dNTP的質量也直接影響PCR反應的成敗。

耐熱DNA聚合酶

PCR之所以能得到廣泛應用，主要是因為Taq DNA聚合酶取代了大腸桿菌DNA聚合酶I大片段。Taq DNA聚合酶是從水生棲熱菌Thermus Aquaticus（Taq）中分離出的熱穩定性DNA聚合酶，使用Taq DNA聚合酶不僅簡化了PCR程序，也極大地增加了PCR特異性及PCR擴增效率。該酶的最適溫度很高（79℃），使引物在高溫下進行退火和延伸，這樣便增加了反應的總強度並減少了與錯配引物的延伸。在PCR反應中，每100μl反應液中含1-2.5u Taq DNA聚合酶為佳，酶的濃度太低會使擴增產物產量降低，如果酶的濃度太高則會出現非特異性擴增。Taq DNA聚合酶保存不當而失活是PCR實驗失敗的常見原因。

溫度循環參數

1．變性溫度與時間

PCR反應中模板DNA的變性十分重要。只有完全性的模板DNA和PCR產物雙鏈完全解開，才能有效的和引物結合。這種結合是PCR擴增的基礎。變性溫度越高，時間越長變性就越充分。但溫度過高、時間過長又會影響Taq DNA聚合酶的活性，所以通常選用變性溫度為95℃30s為宜。在PCR反應中第一個循環變性最重要，需時間較長，因模板DNA的鏈比較長。

2．復性溫度與時間

變性溫度是PCR反應成敗的關鍵，復性溫度決定著PCR的特異性。溫度越低復性越好，但是容易出現引物與靶DNA的錯配，增加非特異性結合，溫度太高不利於復性，大多數PCR反應的復性溫度在55℃左右。確定了復性溫度后，復性時間並不是關鍵因素。但復性時間太長會增加非特異的復性。

3．延伸溫度與時間

引物延伸溫度一般為72℃。這個溫度即考慮了Taq DNA聚合酶的活性，又考慮到引物和靶基因的結合。不合適的延伸溫度不僅會影響擴增產物的特異性，也會影響其產量，72℃時，核苷酸的合成速度為35-100個核苷酸/S，這取決於緩衝體系、pH、鹽濃度和DNA模板的性質。72℃延伸1min對於長達2kb的擴增片段是足夠的。然而，延伸時間過長會導致非特異性擴增帶的出現。對很低濃度底物的擴增，延伸時間要長些。

4．循環數：

循環數決定著擴增的產量。在其它參數都已優化條件下，最適循環數取決於靶序列初始濃度。靶序列的初始濃度較低時、要增加循環次數。另外，酶活性不好，或量不足時也要增加循環次數、以便達到有效的擴增量。

在將Taq DNA聚合酶引入PCR反應，並使之達到自動化之後，PCR反應已變得十分的簡單了。但是PCR樣品的採集及製備卻並非同樣簡單，而且，許多PCR的失敗都歸因於標本的製備不當。用於PCR的標本必須經適當處理后才能使用，因為標本中的許多雜質能抑制Taq DNA聚合酶的活性。另外，處理標本可使待擴增DNA暴露，能與引物復性。關於PCR標本製備各種專業書中介紹了許多，我們實驗發現操作複雜、不慎便容易造成污染，且不實用。現介紹一種簡單快速的處理方法即3%異硫氰酸胍和待檢標本混合100℃，10min，離心取上清作為PCR模板即可。

所有實驗結果都有成功或失敗，實驗的失敗可能是應該出結果而沒有出，我們把它稱作假陰性，不該出結果而出了結果我們把它稱為假陽性。PCR實驗中最常見的問題就是假陰性和假陽性問題。

出現假陰性結果最常見的原因是：Taq DNA聚合酶活力不夠，或活性受到抑制；引物設計不合理；提取的模板質量或數量不過關以及PCR系統欠妥當；循環次數不夠。所以在實驗中出現假陰性失敗時，首先在原來擴增的產物中再加入Taq DNA聚合酶、增加5-10次循環，一般都會獲得成功。如果沒有成功應檢查PCR擴增儀的溫度是否準確，採集標本是否有問題。為了防止假陰性的出現在選用Taq DNA聚合酶時，要注意用活力高質量好的酶。同時在提取PCR模板時，應特別注意防止污染抑制酶活性物質（如酚、氯仿）的存在。儘管Taq DNA聚合酶對模板純度要求不高，但也不允許有破壞性有機試劑的污染。PCR擴增的先決條件及特異性是引物與靶DNA良好的互補，尤其是要絕對保證引物的3′端與靶基因的互補。對變異較大的擴增對象，宜採用巢式（Nested）PCR或double PCR。在進行PCR操作時應注意Mg2+的濃度要合理。PCR反應的各溫度點的設置要合理。

PCR結果的假陽性是對被檢測標本而言，而反應系統中所擴增的產物是真實的。因為PCR技術高度靈敏，極其微量的靶基因污染都會造成大量擴增，而造成結果判斷上的失誤，所以污染是PCR假陽性的主要根源。PCR的污染主要是標本間的交叉污染和擴增子的污染。出現假陽性結果的另一種可能是樣品中存在有靶基因的同源序列。為了避免因污染而造成的假陽性，PCR操作時要隔離不同操作區、分裝試劑、簡化操作程序，使用一次性吸頭。

PCR擴增DNA片段只是一個重要手段。擴增片段的檢測和分析才是目的，根據研究對象和目的的不同而採用不同的分析法。瓊脂糖凝膠電泳可幫助判斷擴增產物的大小，有助於擴增產物的鑒定，點雜交除可鑒定擴增產物外，還有助於產物的分型；Southern雜交分析可從非特異擴增產物中鑒定出特異產物的大小，增加檢測的特異性與敏感性，最近發展的一系列產物分析法（PCR-ELISA,PCR-EIA,PCR-OLA等）均有助於產物的精確分析。

PCR產物可通過瓊脂糖凝膠或聚丙烯醯胺凝膠電泳檢測，以前者最常用，通過電泳可以判斷擴增產物的大小。在臨床檢測中，僅通過凝膠電泳判斷擴增片段大小即可滿足檢測的需要。通常制膠方法為100mlTBE加1.5g瓊脂糖在微波鍋內溶解，稍冷后倒入電泳槽。

電泳后，用溴化乙淀染色20min，然後用去離子水漂洗2次，每次15min，於UV燈下觀察結果並拍照。

凝膠電泳不僅可以鑒定產物的大小，檢測擴增的情況，還可以用來純化擴增產物。

當擴增產物是多條帶時，用點雜交更合適。這種方法的基本過程是，首先將擴增的DNA固定到尼龍膜或硝酸纖維素濾膜上，再用放射性或非放射性標記物標記的探針雜交。點雜交還有助於檢測突變DNA的突變類型，用於人類遺傳病診斷和某些基因的分型。放射性同位素32P標記的寡核苷酸探針檢測的敏感性、特異性和方法的可靠性均不容懷疑，對人們認識某些疾病與基因變異的關係起了很大的作用。但是，由於同位素不穩定和放射性危害，不能常規用於臨床或法醫檢驗，用非放射性物質（生物素、熒光素和地高辛等）標記的寡核苷酸探針分析PCR產物以確定核酸序列變異則是一種簡便而安全的方法。非放射性標記物質穩定性高，使用方便、安全、檢測速度快。

該法是通過一固定於微孔板的捕獲探針與PCR產物的某一區域特異雜交使產物間接地固定於微孔板上。然後，再用一生物素等非放射性標記物標記的檢測探針與產物的另一區域雜交，漂洗后顯色即可判斷結果，該法需要兩個雜交過程來檢測一個產物，因此，其特異性較一次雜交的檢測法高。該法已用於HBV的檢測，其敏感度可達5個HBv DNA分子。此法的敏感性和特異性與PCR 32P探針的Southern雜交法相當。但PCR微孔板夾心雜交法操作簡便、快速、避免了同位素標記探針的危害，顯色反應類似於臨床常規應用的ELISA,適於臨床實驗室常規應用。

本法避免了電泳和雜交的步驟，適於常規ELISA記數儀檢測。因為5'端修飾后仍可進行常規PCR擴增特異靶序列。因此，可以通過修飾一個引物的5′端使其攜帶便於PCR產物固定的功能基因，而通過另一引物5′-端的修飾使產物便於檢測。