分子伴侶

1987年，Ikemura發現枯草桿菌素（subtilisin）的摺疊需要前肽（propeptide）的幫助。這類前肽常位於信號肽與成熟多肽之間，在蛋白質合成過程中與其介導的蛋白質多肽鏈是一前一

后合成出來的，並以共價鍵相連接，是成熟多肽正確摺疊所必需的，成熟多肽完成摺疊后即通過水解作用與前肽脫離。Shinde和Inouye將這類前肽稱為分子內伴侶（intramolecular chaperones）。

分子伴侶是細胞中一大類蛋白質，是由不相關的蛋白質組成的一個家系，它們介導其它蛋白質的正確裝配，但自己不成為最後功能結構中的組分。分子伴侶的概念有三個特點：

①凡具有這種功能的蛋白，都稱為分子伴侶，儘管是完全不同的蛋白質；

②作用機理是不清楚的，故用了“介導”二字，以含糊其辭，“幫助”二字可理解為：通過催化的或非催化的方式，加速或減緩組裝的過程，傳遞組裝所需要的空間信息，也可能抑制組裝過程中不正確的副反應。

③ 分子伴侶一定不是最終組裝完成的結構的組成部分，但不一定是一個分離的實體。如一些蛋白水解酶的前序列，以及一些核糖核蛋白體的加工前的部分，若具分子伴侶的作用，也稱為分子伴侶。組裝的涵意比較廣，主要指：幫助新生肽的摺疊、幫助新生肽成熟為活性蛋白、幫助蛋白質跨膜定位、亞基組裝等。

1987 年 Lasky首先提出了分子伴侶（molecular chaperones）的概念。他將細胞核內能與組蛋白結合併能介導核小體有序組裝的核質素（ nucleoplasmin ）稱為分子伴侶。根據 Ellis 的定義，這一概念延伸為“一類在序列上沒有相關性但有共同功能的蛋白質，它們在細胞內幫助其他含多肽的結構完成正確的組裝，而且在組裝完畢后與之分離，不構成這些蛋白質結構執行功能時的組份”。熱休克蛋白就是一大類分子伴侶。

首先，在蛋白合成過程中，伴侶分子能識別與穩定多肽鏈的部分摺疊的構象，從而參與新生肽鏈的摺疊與裝配。例如，植物光合作用的關鍵酶——二磷酸核酮糖羧化酶加氧酶（Rubisco）在合成時，新合成的亞基單體組裝成全酶（共8 個大亞基、8個小亞基，大亞基基因組葉綠體編碼，小亞基基因組核編碼）之前，就有Rubisco結合蛋白（RBP）參與，實際上就是一種“分子伴侶”。大亞基先與RBP結合，然後與轉運進葉綠體的小亞基裝配成完整的全酶。抗RBP的抗體阻止新合成的亞基裝配成Rubisco。類似的還有大腸桿菌中的“分子伴侶”GroEL，它與GroEs基因構成Gro操縱子，成為熱休克蛋白基因調節因子的重要組成部分，參與侵入噬菌體衣殼的組裝。線粒體基質中的HSP60（單體分子量60KD，但實際上是十四聚體）參與了 H+-ATP酶F1的β-亞基跨越線粒體膜后與其它亞基間的組裝以及鳥氨酸轉氨甲醯酶的摺疊與組裝。內質網膜上的“分子伴侶”免疫球蛋白重鏈結合蛋白 (Bip）能促進跨膜輸入的蛋白質的組裝。隨著基因工程研究的發展，人們還發現將外源基因導入大腸桿菌進行表達時，其產物雖具有預定一級結構，但並未形成具生物活性的空間結構，這提醒人們有必要了解外源基因在原來生物體內表達時是否有分子伴侶的參與？是哪一類分子伴侶的參與？這些問題的澄清無疑將提高基因工程的效益。

在蛋白跨膜運送過程中，也有分子伴侶的參與。核糖體上新合成的多肽在定向跨膜運送到不同細胞器時，要維持非摺疊狀態。分子伴侶Hsp70家族在蛋白移位中就能打開前體蛋白的摺疊，這時跨膜蛋白疏水基團外露，分子伴侶能夠識別並與之結合，保護疏水面，防止相互作用而凝聚，直至跨膜運送開始。跨膜運送后，分子伴侶又參與重摺疊與組裝過程。

另外，特別值得一提的是，有一類分子伴侶屬於熱休克蛋白 (HSP）。這種蛋白是1962年Ritossa在研究果蠅唾腺染色體時首先發現的。果蠅一般在25℃正常生長，當外界溫度升至30～40℃時，果蠅體內產生較多的HSP。後來又在酵母、玉米、大豆、大腸桿菌等中發現。當外界溫度高出正常生長溫度10～15℃，HSP大量誘生。近年來的研究表明在正常生長條件下，這類HSP仍少量存在。以前認為HSP功能是機體為應付不良環境產生對熱變性蛋白的修復，進一步研究才知正常生理條件下，HSP對蛋白跨膜運輸，結構摺疊也有重要作用。上面提及的HSP70、HSP60、GroEL都屬於HSP。

分子伴侶的作用機理還了解不多，很多問題有待進一步探討。很有意義的是，每一類分子伴侶在進化上都具有較大的保守性。例如，大腸桿菌中參與噬菌體衣殼組裝GroEL與植物葉綠體中Rubisco亞基結合蛋白RBP、線粒體基質中參與鳥氨酸轉氨甲醯酶的摺疊與組裝的HSP60，它們的氨基酸組成上彼此有50%的同源性。抗RBP的抗體甚至與植物、人類、酵母和爪蟾的應激蛋白有交叉反應。

總之，關於分子伴侶的研究才剛剛起步，很多問題還有待深入。又由於分子伴侶對許多蛋白質在細胞內生命活動的發揮至關重要，它必將成為蛋白質化學、分子生物學研究中一個很活躍的領域。

分子伴侶不僅是胞內蛋白摺疊、組裝與轉運的幫助蛋白，更令人驚奇的是它還可以成為感染性疾病中的免疫優勢抗原（immunodominant antigens），激發宿主體內的體液免疫反應和T細胞介導的細胞免疫反應，證實在細菌或寄生蟲感染中具有免疫保護作用（Minowanda 1995,Young 1992）。這說明分子伴侶有可能用作疫苗，來抵抗微生物的感染，並用來治療腫瘤和自身免疫疾病（Suto 1995）。用一個96Ku的腫瘤相關分子伴侶免疫腫瘤病人，已進入一期臨床實驗（Edgington 1995）。動物疾病模型中的胰島素依賴型糖尿病、風濕病等可被分子伴侶cpn60抑制，可能是cpn60-反應性T淋巴細胞起了作用。某些情況下，分子伴侶如cpn10中的妊娠早期因子（early pregnancy factors,EPF）具有免疫抑制作用，因而具有安胎、防止習慣性流產等治療價值（Cavanagh 1994）。生理情況下，誘導熱休克蛋白Hsp70等的過度表達，能使機體具有更高的缺血耐受能力，減少急性成人呼吸窘迫症造成的器官損害（Currie 1993）。眼球晶狀體中的（-晶體蛋白（（-crystallin）可以防止其他晶體蛋白的聚集和濁化，因而能夠防治白內障（Graw 1997）。隨著年齡的增長和受紫外線照射累加效應的影響，可導致（-晶體蛋白的分子伴侶活性減弱，這常常是老年性白內障的病因之一。而有些藥物如阿斯匹林、indomethacin等也能介導產生熱休克反應。

細胞內新生肽鏈的摺疊過程中，其正確摺疊需要幫助蛋白如分子伴侶和摺疊酶等的參與和介導；而蛋白質的降解還可以由分子伴侶提供的“質控系統（quality control system）”輔助完成（Hammond 1995，）。這種“質控系統”可以識別（recongnizing）、滯留（retaining）和靶向作用（targeting）於錯誤摺疊的蛋白質，促進這些蛋白質聚集或降解，阻礙其正常定位，防止它們干擾細胞的正常功能。

但也可以導致疾病的發生。已知許多編碼基因的細微突變如點突變或個別氨基酸的缺失，編碼蛋白還具有絕大部分生物活性，只是出現蛋白產物極細微的摺疊異常，卻可導致疾病的發生。部分原因是“質控系統”在發揮作用：蛋白產物極細微的摺疊異常，雖然對活性影響不大，卻可以被分子伴侶等識別而滯留在內質網，不能實現正常的轉位、轉運或分泌，從而不能到達生理位置執行正常的功能，導致疾病發生。

典型的例子有抗胰蛋白酶缺陷病（Teckman 1995）。一種情況是因為抗胰蛋白酶發生Glu?(?Lys的Z突變時，僅有15%的蛋白質分泌出來，其餘全部滯留在內質網（ER）。這種滯留的原因部分是由ER的分子伴侶calnexin介導了摺疊異常的突變蛋白的聚集。而異常產物的聚集大大妨礙了細胞的正常活動，導致肝硬化（cirrhosis）或肺氣腫（emphysema）的發生。另一種疾病是囊性纖維化（cysticfibrosis,CF），囊性纖維性跨膜遞質調節蛋白（CFTR）是位於胞膜的cAMP激動型氯離子通道，野生型CFTR有12個跨膜結構域（membrane-spanning domains），大部分位於胞漿。新生CFTR多肽鏈在ER至少與兩個以上的分子伴侶如calnexin和Hsp70形成複合物，脫離分子伴侶的“護送”方可轉運至細胞膜（Yang 1993; Pind 1994）。超過70%的CF病人中，CFTR蛋白第508位的苯丙氨酸Phe發生缺失（ΔF508 CFTR），突變體僅有細微的構象變化，但能被“質控系統”識別並將其滯留在內質網，ΔF508 CFTR發生聚集，甚至降解，從而它的轉運速度跟不上胞膜氯離子通道蛋白的更新速度，細胞功能受限。實際上，這種只有摺疊細微變化的蛋白在特定條件下如低溫時，仍可以轉運至胞膜，具有絕大部分生理活性（Denning 1992）。可以設想，治療這種疾病，並不一定非要進行基因治療不可，而只要完善其轉運途徑即可。如甘油（glycerol）、二甲基亞碸DMSO(dimethylsulfoxide）和氘化水（deuterated water）等，以及細胞內的氮氧化物三甲亞碸（trimethysulfoxide N-oxide），可以穩定蛋白，增加溶解度，減少CFTR突變蛋白的降解，實現正常運輸（Brown 1996）。對應於大分子的分子伴侶，這些小分子的蛋白穩定劑，又稱為化學伴侶（chemical chaperones）。

細胞內存在的對抗高滲的滲透劑（osmolytes）就是典型的一類（Welch 1996）：碳水化物中除甘油外，還有sorbitol、arabitol、myo-inositol及trehalose；氨基酸及氨基酸衍生物中的甘氨酸等；甲胺類物質中的TMAO，甘油磷酸膽鹼（glycero-phosphorylcholine）。當然，並不是所有的蛋白摺疊異常導致定位異常。如一些神經系統疾病Alzheimer's病和prion蛋白粒子病，突變蛋白並沒有滯留在轉運途中，可以到達正常定位位置）。突變蛋白之間的相互作用導致蛋白質發生錯誤摺疊，因為降解不徹底而形成不溶性沉澱。不溶性沉澱形成過多，嚴重干擾正常的神經活動，引起失能，屬於“摺疊病（fold diseases）”。prion蛋白粒子病中致病性蛋白（pathogenic prion protein,PrPsc）的聚集，是因為蛋白構象中的一個或多個α螺旋變成了β片層，進入大腦後還能使正常的PrPc（normal PrP）蛋白變成異常的PrPsc蛋白，象介導錯誤摺疊的“模板”，稱為“病理性伴侶分子”（pathological chaperones），因而具有感染能力。一些蛋白穩定劑如甘油、DMSO和三甲亞碸等，可以阻止正常蛋白的異常化。Alzheimer's病澱粉樣β蛋白N端發生Glu22(Gln的突變時，減少了N端α螺旋的含量，促進了澱粉樣變的發生；而引入單個氨基酸突變Val18(Ala，則可以顯著增加N端α螺旋的含量，減少了蛋白的澱粉樣纖維化。還有其他疾病如遺傳性cystatin C澱粉樣變，門冬氨醯葡糖胺缺乏症（Aspartylglycosaminuria），以及一些顯性遺傳性神經元退變疾病如Huntington’s舞蹈病，脊髓/延髓性肌萎縮（spinal/bulbar muscular atrophy ），I型脊髓小腦性共濟失調（spinocerebellar ataxia type I），紅色齒狀核-蒼白球萎縮（dentatorubral-pallidoluysian atrophy），Machado-Joseph疾病（Machado-Joseph desease）均是由於蛋白質突變造成異常摺疊，有的形成纖維狀聚集物，嚴重干擾神經系統的正常功能。有的突變蛋白聚集后被降解則引起缺乏症（Ruddon 1996）。有些激素分子如hCG的摺疊缺陷還可以引起婦科的惡性腫瘤，有些癌細胞因此缺少正常的細胞外基質（Ruddon 1996）。看來許多遺傳性疾病或基因突變疾病實際上是摺疊病。

另外，病原體結合的分子伴侶免疫原性很強，在宿主體內能誘發產生某些免疫疾病，如結核，Ieprosy，Legionnaire's病，Iyme病，Q熱（Q fever）等（Schoel 1994）。而分子伴侶本身的變化，如cpn10的表達水平下降，可能與全身性致命性線粒體疾病（Agsteribbe 1993）有關。因而，對分子伴侶在各種病理現象中的作用的研究是非常必要的。

Cpn 家族是具有獨特的雙層 7-9 元環狀結構的寡聚蛋白，它們以依賴 ATP 的方式促進體內正常和應急條件下的蛋白質摺疊。Cpns 又分為兩組：GroEL(Hsp60) 家族和TriC 家族。GroEL 型的 Cpns 存在於真細菌、線粒體和葉綠體中，由雙層 7 個亞基組成的圓環組成，每個亞基分子量約為 60Ku。它們在體內與一種輔助因子，如E. coli 中的GroES ，協同作用以幫助蛋白摺疊。除了葉綠體中的類似物外，這些蛋白是應急反應誘導的。人們對GroEL 和GroES 的結構、功能及其作用機製做了十分詳盡的研究。TRiC 型（ TCP-1 環狀複合物）存在於古細菌和真核細胞質中，由雙層 8 或 9 元環組成，亞基分子量約為 55K ，與小鼠中 TCP-1 尾複合蛋白（ TCP-1 tail complex protein ）有同源性。這種 Cpn 沒有類似 GroES 的輔助因子，而且只有古細菌中的成員有應急誘導性；

應激蛋白70 家族又稱為熱休克蛋白70 家族（Hsp70 family ），是一類分子量約70Ku 的高度保守的 ATP 酶，廣泛地存在於原核和真核細胞中，包括大腸桿菌胞漿中的 DnaK/ Dna

J ，高等生物內質網中的 Bip 、 Hsc1 、 Hsc 2 、Hsc 4 或Hsc70 ，胞漿中的 Hsp70 、 Hsp68 和 Ssal4p ，線粒體中的Ssclp 、 Hsp70 等。在細胞應急和非應急條件下的蛋白質代謝，如蛋白質的從頭摺疊（de novo protein folding) 、跨膜運輸、錯誤摺疊多肽的降解及其調控過程中有重要的作用。在體內，Hsp70 家族成員的主要功能是以 ATP 依賴的方式結合未摺疊多肽鏈的疏水區以穩定蛋白質的未摺疊狀態，再通過有控制的釋放幫助其摺疊。

即熱休克蛋白 90 家 族（Hsp90 family ），分子量在90Ku 左右，包括大腸桿菌胞漿中的HtpG ，酵母胞漿中的Hsp83 與Hsc83 ，果蠅胞漿中的Hsp83 ，以及哺乳類胞漿中的Hsp90 與內質網中的Grp94（ Erp90 或內質網素endoplasmin ）等。Hsp 90 可以與胞漿中的類固醇激素受體結合，封閉受體的DNA 結合域，阻礙其對基因轉錄調控區的激活作用，使之保持在天然的非活性狀態，但Hsp90 的結合也使受體保持著對激素配體的高親和力。Hsp90 還與 Ras 信號途徑中許多信號分子的摺疊與組裝密切相關，主要是Hsp90 的結合與解離，介導了這些分子在非活性形式與活性形式間的轉化。如轉化型

酪氨酸激酶pp60v-src 或在一定條件下，從Hsp90 等與之形成的複合物中釋放，才能轉位至胞膜，行使激酶的活性功能。Casein(CKII) 和 el/f-2a 是兩種絲氨酸 / 蘇氨酸蛋白激酶，其中Casein(CKII) 與細胞生長和細胞周期有關，el/f-2a 激酶則調節蛋白質合成，兩者均可與Hsp90 及其他分子伴侶形成複合物。除 Hsp90 以外，其他分子伴侶如Hsp70,PPIs 等都影響了受體分子的激活過程。

此外，其他的分子伴侶還有核質素、T 受體結合蛋白 (TRAP) 、大腸桿菌的SecB 和觸發因子（trigger factor ）及 PapD 、噬菌體編碼的支架蛋白（scaffolding proteins ）等。分子伴侶不僅與胞內蛋白的摺疊與組裝密切相關，影響到蛋白質的轉運、定位或分泌；而且與信號轉導中的信號分子的活性狀態與活性行為相關連，具有重要的生理意義。

從參與促進一個反應而本身不在最終產物中出現這一點來看，分子伴侶具有酶的特徵。但從以下三方面來看，分子伴侶和酶很不同。

1、分子伴侶對靶蛋白沒有高度專一性，同一分子伴侶可以促進多種氨基酸序列完全不同的多肽鏈摺疊成為空間結構、性質和功能都不相關的蛋白質。

2、它的催化效率很低。行使功能需要水解ATP，以改變其構象，釋放底物，進行再循環。

3、它和肽鏈摺疊的關係，是阻止錯誤摺疊，而不是促進正確摺疊。

4.多能性（脅迫保護防止交聯聚沉，轉運，調節轉錄和複製，組裝細胞骨架）

5. 進化保守性