碳同化

如前所述，早在十九世紀末，人們就知道光合作用需要CO2和H2O，產物是糖和澱粉，但是對於CO2是如何被還原成碳水化合物的具體步驟尚不清楚。直到20世紀40年代中期，美國加州大學的卡爾文（M.Calvin）和本森（A.Benson）採用當時的兩項新技術：放射性同位素示蹤和雙向紙層析，以單細胞藻類作為試驗材料，用14CO2飼餵，照光從數秒到幾十分鐘不等，然後在沸騰的酒精中殺死材料以終止生化反應，用紙層析技術分離同位素標記物，以標記物出現的先後順序來確定二氧化碳同化的每一步驟。經十年的系統研究，在50年代提出了二氧化碳同化的循環途徑，故稱為卡爾文循環(The Calvin cycle)。由於這個循環中CO2的受體是一種戊糖(核酮糖二磷酸)，故又稱為還原戊糖磷酸途徑（reductive pentose phosphate pathway，RPPP）。這個途徑中二氧化碳被固定形成的最初產物是一種三碳化合物，故稱為C3途徑。卡爾文循環具有合成澱粉等產物的能力，是所有植物光合碳同化的基本途徑，大致可分為三個階段，即羧化階段、還原階段和再生階段。

核酮糖-1,5-二磷酸（RuBP）在核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶（ribulose bisphosphate carboxylase/oxygenase,Rubisco）催化下，與CO2結合，產物很快水解為二分子3-磷酸甘油酸（3-PGA）反應過程。Rubisco是植物體內含量最豐富的酶，約佔葉中可溶蛋白質總量的40%以上，由8個大亞基（約56KD）和8個小亞基（約14KD）構成，活性部位位於大亞基上。大亞基由葉綠體基因編碼，小亞基由核基因編碼。

3-磷酸甘油酸在3-磷酸甘油酸激酶（PGAK）催化下，形成1,3-二磷酸甘油酸（DPGA)，然後在甘油醛磷酸脫氫酶作用下被NADPH還原，變為甘油醛-3-磷酸（GAP），這就是CO2的還原階段。

羧化階段產生的PGA是一種有機酸，尚未達到糖的能級，為了把PGA轉化成糖，要消耗光反應中產生的同化力。ATP提供能量，NADPH提供還原力使PGA的羧基轉變成GAP的醛基，這也是光反應與暗反應的聯結點。當CO2被還原為GAP時，光合作用的貯能過程即告完成。

是由GAP經過一系列的轉變，重新形成CO2受體RuBP的過程。這裡包括了形成磷酸化的3-、4-、5-、6-、7-碳糖的一系列反應(見圖3-10)。最後一步由核酮糖－5－磷酸激酶(Ru5PK)催化，並消耗1分子ATP，再形成RuBP，構成了一個循環。C3途徑的總反應式為：

3CO2 + 5H2O + 9ATP + 6NADPH+6H+ →GAP + 9ADP + 8Pi + 6NADP+

由上式可見，每同化一個CO2，要消耗3個ATP和2個NADPH。還原3個CO2可輸出一個磷酸丙糖(GAP或DHAP)。磷酸丙糖可在葉綠體內形成澱粉或運出葉綠體，在細胞質中合成蔗糖。若按每同化1molCO2可貯能478kJ,每水解1molATP和氧化1molNADPH可分別釋放能量32kJ和217kJ計算，則通過卡爾文循環同化CO2的能量轉換效率為90%。(即478/（32×3+217×2），由可見，其能量轉換效率是非常高的。

在20世紀60年代以後，人們對光合碳循環的調節已有了較深入的了解。C3途徑的調節有以下幾方面：

自動催化調節作用

CO2的同化速率，在很大程度上決定於C3途徑的運轉狀況和中間產物的數量水平。將暗適應的葉片移至光下，最初階段光合速率很低，需要經過一個“滯後期”（一般超過20min，取決於暗適應時間的長短）才能達到光合速率的“穩態”階段。其原因之一是暗中葉綠體基質中的光合中間產物(尤其是RuBP)的含量低。在C3途徑中存在一種自動調節RuBP水平的機制，即在RuBP含量低時，最初同化CO2形成的磷酸丙糖不輸出循環，而用於RuBP再生，以加快CO2固定速率；當循環達到“穩態”后，磷酸丙糖才輸出。這種調節RuBP等中間產物數量，使CO2的同化速率處於某一“穩態”的機制，稱為C3途徑的自動催化調節。

光調節作用

碳同化亦稱為暗反應。然而，光除了通過光反應提供同化力外，還調節著暗反應的一些酶活性。例如Rubisco、PGAK、FBPase、SBPase、Ru5PK屬於光調節酶。在光反應中，H+被從葉綠體基質中轉移到類囊體腔中，同時交換出Mg2+。這樣基質中的pH值從7增加到8以上，Mg2+的濃度也升高，而Rubisco在pH8時活性最高，對CO2親和力也高。其他的一些酶，如FBPase、Ru5PK等的活性在pH8時比pH7時高。在暗中，pH≤7.2時，這些酶活性降低，甚至喪失。Rubisco活性部位中的一個賴氨酸的ε-NH2基在pH較高時不帶電荷，可以與在光下由Rubisco活化酶（activase）催化，與CO2形成帶負電荷的氨基酸，後者再與Mg2+結合，生成酶-CO2- Mg2+活性複合體（ECM），酶即被激活。光還通過還原態Fd產生效應物——硫氧還蛋白（thioredoxin, Td）又使FBPase和Ru5PK的相鄰半胱氨酸上的巰基處於還原狀態，酶被激活；在暗中，巰基則氧化形成二硫鍵，酶失活。

光合產物輸出速率的調節

光合作用最初產物磷酸丙糖從葉綠體運到細胞質的數量，受細胞質中Pi水平的調節。磷酸丙糖通過葉綠體膜上的Pi運轉器運出葉綠體，同時將細胞質中等量的Pi運入葉綠體。當磷酸丙糖在細胞質中合成為蔗糖時，就釋放出Pi。如果蔗糖從細胞質的外運受阻，或利用減慢，則其合成速度降低，Pi的釋放也隨之減少，會使磷酸丙糖外運受阻。這樣，磷酸丙糖在葉綠體中積累，從而影響C3光合碳還原循環的正常運轉。

在20世紀60年代，發現有些起源於熱帶的植物，如甘蔗、玉米等，除了和其它植物一樣具有卡爾文循環以外，還存在一條固定CO2的途徑。它固定CO2的最初產物是含四個碳的二羧酸，故稱為C4-二羧酸途徑（C4－dicarboxylic acid pathway），簡稱C4途徑。由於這個途徑是M.D.Hatch和C.R.Slack發現的，也叫Hatch-Slack途徑。現已知被子植物中有20多個科近2 000種植物按C4途徑固定CO2，這些植物被稱為C4植物。而把只具有C3途徑的植物稱為C3植物。

C4途徑的CO2受體是C4植物葉肉細胞胞質中的磷酸烯醇式丙酮酸（phosphoenol pyruvate,PEP），在磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）的催化下，固定HCO3-(CO2溶解於水)，生成草醯乙酸（oxaloacetic acid, OAA）。草醯乙酸由NADP-蘋果酸脫氫酶(malic acid dehydrogenase)催化，被還原為蘋果酸（malic acid,Mal），反應在葉綠體中進行。但是，也有植物，其草醯乙酸與谷氨酸在天冬氨酸轉氨酶(aspartate amino transferase)作用下，OAA接受谷氨酸的氨基，形成天冬氨酸（aspartic acid,Asp），反應在細胞質中進行。這些蘋果酸或天冬氨酸接著被運到維管束鞘細胞（bundle sheath cell,BSC）中去。四碳二羧酸在BSC中脫羧后變成的丙酮酸（pyruvic acid），再從維管束鞘細胞運回葉肉細胞，在葉綠體中，經丙酮酸磷酸雙激酶(pyruvatephosphatedikinase,PPDK)催化和ATP作用，生成CO2的受體PEP，使反應循環進行，而四碳二羧酸在BSC葉綠體中脫羧釋放的CO2，由BSC中的C3途徑同化。

根據運入維管束鞘的C4二羧酸的種類以及參與脫羧反應的酶類，C4途徑又分三種類型。一是依賴NADP-蘋果酸酶(malic enzyme)的蘋果酸型(NADP-ME型)，如玉米、甘蔗、高粱等即屬此類；二是依賴NAD-蘋果酸酶的天冬氨酸型(NAD-ME型)，龍爪稷、蟋蟀草、狗芽根、馬齒莧等屬於此類；三是具有PEP羧激酶(PEP carboxy kinase, PCK)的天冬氨酸型，羊草、無芒虎尾草、衛茅、鼠尾草等屬於此類。NADP-ME型的初期產物是MAL，而NAD-ME型和PCK型的初期產物是Asp。

C4二羧酸從葉肉細胞轉移到BSC內脫羧釋放CO2，使BSC內的CO2濃度可比空氣中高出20倍左右，相當於一個“CO2”泵的作用，能有效抑制Rubisco的加氧反應，提高CO2同化速率。同時PEPC對CO2的Km值為7μmol,而Rubisco對CO2的Km值為450μmol，即PEPC對CO2的親和力高，因此，C4途徑的CO2同化速率高於C3途徑。C4途徑的酶活性受光、代謝物運輸的調節。光可活化C4途徑中的PEPC、NADP-蘋果酸脫氫酶和丙酮酸磷酸二激酶（PPDK），在暗中這些酶則被鈍化。蘋果酸和天冬氨酸抑制PEPC活性，而G6P、PEP則增加其活性。Mn2+和Mg2+是C4植物NADP－蘋果酸酶、NAD－蘋果酸酶、PEP羧化激酶的活化劑。

在乾旱地區生長的景天科、仙人掌科等植物有一個特殊的CO2同化方式：夜間氣孔開放，吸收CO2，在PEPC作用下與糖酵解過程中產生的PEP結合形成OAA，OAA在NADP-蘋果酸脫氫酶作用下進一步還原為蘋果酸，積累於液胞中，表現出夜間澱粉、糖減少，蘋果酸增加，細胞液變酸。白天氣孔關閉，液胞中的蘋果酸運至細胞質在NAD-或ANDP-蘋果酸酶、或PEP羧激酶催化下氧化脫羧釋放CO2，再由C3途徑同化；脫羧后形成的丙酮酸和PEP則轉化為澱粉（圖3-12）。丙酮酸也可進入線粒體，也被氧化脫羧生成CO2進入C3途徑，同化為澱粉。所以白天表現出蘋果酸減少，澱粉、糖增加，酸性減弱。這種有機酸合成日變化的光合碳代謝類型稱為景天科酸代謝（crassulacean acid metabolism,CAM）途徑。

CAM途徑最早是在景天科植物中發現的，目前已知在近30個科，100多個屬，1萬多種植物中有CAM途徑，主要分佈在景天科、仙人掌科、蘭科、鳳梨科、大戟科、百合科、石蒜科等植物中。

CAM植物多起源於熱帶，分佈於乾旱環境中。因此，CAM植物多為肉質植物(但並非所有的肉質植物都是CAM植物)，具有大的薄壁細胞，內有葉綠體和大葉泡。

根據植物在一生中對CAM的專營程度，CAM植物又分為兩類：一類為專性CAM植物，其一生中大部分時間的碳代謝是CAM途徑；另一類為兼性CAM植物，如冰葉日中花（ice plant），在正常條件下進行C3途徑，當遇到乾旱、鹽漬和短日照時則進行CAM途徑，以抵抗不良環境。

CAM途徑與C4途徑基本相同，二者的差別在於C4植物的兩次羧化反應是在空間上(葉肉細胞和維管束鞘細胞)分開的，而CAM植物則是在時間上(黑夜和白天)分開的。

綜上所述，植物的光合碳同化途徑具有多樣性，這也反映了植物對生態環境多樣性的適應。但C3途徑是光合碳代謝最基本最普遍的途徑，同時，也只有這條途徑才具備合成澱粉等產物的能力，C4途徑和CAM途徑可以說是對C3途徑的補充。

植物的綠色細胞在光下吸收氧氣，放出二氧化碳的過程稱為光呼吸(photorespiration)。這種呼吸僅在光下發生，且與光合作用密切相關。一般生活細胞的呼吸在光照和黑暗中都可以進行，對光照沒有特殊要求，稱為暗呼吸。

光呼吸與暗呼吸在呼吸底物、代謝途徑以及對O2和CO2濃度的反應等方面均不相同。另外，光呼吸速率比暗呼吸速率高3～5倍。

光呼吸的生化歷程

光呼吸是一個氧化過程，被氧化的底物是乙醇酸（glycolate）。乙醇酸的產生則以RuBP為底物，催化這一反應的酶是Rubisco。這種酶是一種兼性酶，具有催化羧化反應和加氧反應兩種功能。其催化方向取決於CO2和O2的分壓。當CO2分壓高而O2分壓低時，RuBP與CO2經此酶催化生成2分子的PGA；反之，則RuBP與O2在此酶催化下生成1分子PGA和1分子磷酸乙醇酸(C2化合物)，後者在磷酸乙醇酸磷酸（酯）酶的作用下變成乙醇酸。

光呼吸與暗呼吸的區別

1.底物

光呼吸：在光下由Rubisco加氧反應形成的乙醇酸，底物是新形成的。

暗呼吸：可以是碳水化合物，脂肪或蛋白質，但最常見的底物是葡萄糖。底物可以是新形成的，也可以是貯存物。

2.代謝途徑

光呼吸：乙醇酸代謝途徑，或稱C2途徑

暗呼吸：糖酵解，三羧酸循環，磷酸戊糖途徑

3.發生部位

光呼吸：只發生在光合細胞里，在葉綠體、過氧化體和線粒體三種細胞器協同作用下進行。

暗呼吸：在所有活細胞的細胞質和線粒體中進行。

4.對O2 和CO2濃度的反應

光呼吸：在O2濃度1-100%範圍內，光呼吸隨氧濃度提高而增強，高濃度的CO2抑制光呼吸。

暗呼吸：一般而言，O2和CO2濃度對暗呼吸無明顯影響。

5.反應部位、條件

光呼吸：光下、綠色細胞

暗呼吸：光、暗處生活細胞

光呼吸的全過程需要由葉綠體、過氧化體和線粒體三種細胞器協同完成，這是一個環式變化過程。光呼吸實際上是乙醇酸代謝途徑，由於乙醇酸是C2化合物，因此光呼吸途徑又稱C2循環。

在葉綠體中形成的乙醇酸轉至過氧化體，由乙醇酸氧化酶催化，被氧化成乙醛酸和H2O2，後者由過氧化氫酶催化分解成H2O和O2。乙醛酸經轉氨酶作用變成甘氨酸，進入線粒體。2分子甘氨酸在線粒體中發生氧化脫羧和羥甲基轉移反應轉變為1分子絲氨酸，併產生NADH、NH3，放出CO2。絲氨酸轉回到過氧化體，並與乙醛酸進行轉氨作用，形成羥基丙酮酸，後者在甘油酸脫氫酶作用下，還原為甘油酸。最後，甘油酸再回到葉綠體，在甘油酸激酶的作用下生成PGA，進入卡爾文循環，再生RuBP，重複下一次C2循環。在這一循環中，2分子乙醇酸放出1分子CO2(碳素損失25%)。O2的吸收發生於葉綠體和過氧化體內，CO2的釋放發生在線粒體內。

光呼吸的生理功能

從碳素同化的角度看，光呼吸將光合作用固定的20%～40%的碳變為CO2放出；從能量的角度看，每釋放1分子CO2需要消耗6.8個ATP和3個NADPH。顯然，光呼吸是一種浪費。

CO2和O2競爭Rubisco的同一活性部位，並互為加氧與羧化反應的抑製劑。Rubisco催化反應的方向，是進行光合作用還是光呼吸，取決於外界CO2與O2濃度的比值。大氣中CO2/O2比值很低，加氧酶活性就不可避免地表現出來。既然在空氣中綠色植物光呼吸是不可避免的，那它在生理上有什麼意義呢？目前認為其主要生理功能如下：

1．消除乙醇酸的毒害：乙醇酸的產生在代謝中是不可避免的。光呼吸消除乙醇酸的代謝作用，避免了乙醇酸積累，使細胞免受傷害。

2．維持C3途徑的運轉：在葉片氣孔關閉或外界CO2濃度降低時，光呼吸釋放的CO2能被C3途徑再利用，以維持C3途徑的運轉。

3．防止強光對光合機構的破壞：在強光下，光反應中形成的同化力會超過暗反應的需要，葉綠體中NADPH/NADP+的比值增高，最終電子受體NADP+不足，由光激發的高能電子會傳遞給O2，形成超氧陰離子自由基，對光合機構具有傷害作用，而光呼吸可消耗過剩的同化力，減少的形成，從而保護光合機構。

4．氮代謝的補充：光呼吸代謝中涉及多種氨基酸(甘氨酸、絲氨酸等)的形成和轉化過程，它對綠色細胞的氮代謝是一個補充。

5． C3植物、C4植物、C3-C4中間植物和CAM植物的光合特徵比較

根據高等植物光合作用碳同化途徑的不同，可將植物劃分成為C3植物、C4植物、C3－C4中間植物和CAM植物。但研究發現，高等植物的光合碳同化途徑也可隨著植物的器官、部位、生育期以及環境條件而發生變化。例如，甘蔗是典型的C4植物，但其莖桿葉綠體只具有C3途徑；高粱也是典型的C4植物，但其開花后便轉變為C3途徑；高冷盤在短日照下為CAM植物，但在長日照、低溫條件下卻變成了C3植物。冰葉日中花，在水分脅迫時具有CAM途徑，而水分狀況適宜時，則主要依靠C3途徑進行光合作用。

C3植物、C4植物C3－C4中間植物和CAM植物的結構、生理特徵比較

1.結構

C3植物：BSC不發達，不含葉綠體，其周圍葉肉細胞排列疏鬆

C4植物：BSC含葉綠體，其周圍葉肉細胞排列緊密呈“花環型”結構（kranz type）

C3－C4中間的植物：BSC含葉綠體，但BSC的壁較C4植物的薄

CAM植物：BSC不發達，不含葉綠體，含較多線粒體，葉肉細胞的液泡大

2.葉綠素a/b

C3植物：2．8±0.4

C4植物：3．9±0.6

C3－C4中間的植物：2．8～3.9

CAM植物：2．5～3.0

3.CO2補償點(μg L-1)>40

C3植物：5左右

C4植物：5～40

C3－C4中間的植物：光照下:0～200；黑暗中：<5

4.合固定CO2的途徑

C3植物：只有C3途徑

C4植物：C4途徑和C3途徑

C3－C4中間的植物：C3途徑和有限的C4途徑

CAM植物：CAM途徑和C3途徑

5.O2固定酶

C3植物：Rubisco

C4植物：PEPC,Rubisco

C3－C4中間的植物：PEPC,Rubisco

CAM植物：PEPC,Rubisco

6.O2最初接受體

C3植物：RuBP

C4植物：PEP

C3－C4中間的植物：RuBP,PEP（少量）

CAM植物：光下:RuBP；暗中：PEP

7.CO2固定最初產物

C3植物：PGA

C4植物：OAA

C3－C4中間的植物：PGA，OAA

CAM植物：光下:PGA；黑暗中：OAA

8.EPC活性(μmol·mg-1.chl.min-1)

C3植物：0.30～0.35

C4植物：16～18

C3－C4中間的植物：< 16

CAM植物：19．2

9.最大凈光合速率(μmolCO2 m-2·s-1)

C3植物：15～35

C4植物：40～80

C3－C4中間的植物：30～50

CAM植物：1～4

10.光呼吸

C3植物：3．0～3.7

C4植物：≈0

C3－C4中間的植物：0.6～1.0

CAM植物：≈0

11.同化產物分配

C3植物：慢

C4植物：快

C3－C4中間的植物：中等

CAM植物：不等

12.蒸騰係數

C3植物：450～950

C4植物：250～350

C3－C4中間的植物：中等

CAM植物：光下150～600；暗中18～100

到了20世紀70年代，又發現某些植物形態解剖結構和生理生化特性介於C3植物和C4植物之間，被稱為C3－C4中間植物。迄今已發現在禾本科、栗米草科、莧科，菊科、十字花科及紫茉莉科等科植物中有數十種C3－C4中間植物，如黍屬的Panicum milioides 和P.Schenckii等。然而，大多數C3植物、C4植物、C3－C4中間植物及CAM植物的形態解剖結構和生理生化特性還是相對穩定的，有區別的，見表3－5。一般而言，C4植物具有較高的光合效率，特別是在低CO2濃度、高溫、強光。