突變株
指在核苷酸鏈特定位點的一個或多個核苷的永久性改變
突變是指在核苷酸鏈特定位點的一個或多個核苷的永久性改變。而發生突變的菌株就稱為突變株。突變可能涉及到染色體上一個或多個核苷對的替換、刪除或重排,這種突變稱為點突變。DNA的錯誤聚合可能會使突變率提高。通常基因在任何一點發生突變的概率是很低的(10-5-10-10/代)。並且,在大多數情況下突變是有害的,但是特定的突變往往會使微生物更好的適應環境和改進其本身的生物催化性能。因此,困難在於分離那些有優良特性的突變株。
其類型包括:(1)形態突變株,如影響細胞結構、細胞形態、菌落形態和噬菌斑形態等的突變株;(2)生理生化突變株,如營養缺陷突變型和影響糖的分解利用或色素的產生等突變株;(3)抗性突變株,如耐藥性、噬菌體抗性和紫外線抗性等突變株。(4)條件致死突變株,如溫度敏感突變株等。
基因突變分為自發和誘發。原因可以是細胞分裂時遺傳基因的複製發生錯誤、或受化學物質、射線、或病毒的影響。一般具有四種特徵:1,突變的重演性和可逆性;2,突變的多方向性和復等位基因。3,突變的有害和有利性;4.,突變的平行性。
突變通常會導致細胞運作不正常、或細胞死亡,甚至可以在較高等生物中引發癌症。但同時,突變也被視為物種進化的推動力:不理想的突變會經天擇過程被淘汰,而對物種有利的突變則會被累積下去。中性的突變對物種沒有影響而逐漸累積,導致間斷平衡。
指因病毒粒子中所含有的核酸量的增減而引起病毒粒子的飄浮密度發生變化的突變株。λ,T7等噬菌體DNA發生部分缺失而變短時,若缺失部分不含有必不可少的信息,則也能形成感染粒子。也有因整合了宿主菌的DNA片斷而分子量變得比野生型更大的。雖然這些噬菌體粒子的DNA含量不同,但外殼蛋白質的量是一定的,所以它們的密度與野生型噬菌體的密度不一樣。用氯化銫之類的密度梯度離心法能分離出相應的DNA含量不同的各種粒子。
1.1材料
篩選突變株
1.2方法
1.2.1鋪板,用50μg/mL卡那黴素或/和3μg/mL四環素篩選抗性克隆,37℃12~20h。以LB洗下克隆,適當稀釋,部分以甘油凍存。適當稀釋后,接種於50mLLB-50μg/mL卡那黴素和/或3μg/mL四環素,37℃培養6h至指數生長期。
1.2.3酵母轉化取3μg純化的質粒,經NotI內切酶消化(根據內切酶附說明書),電泳,培養10mLINVSc1酵母菌至指數生長期(30℃,36~48h),OD600=1,離心收集細胞,以5mL轉化緩衝液清洗一次(轉化buffer:0.2mol/LLiAC,40%PEG4000,100μmol/Lβ-ME(巰基乙醇))。將細胞重新懸浮於1mL轉化緩衝液中,含1mg變性鮭魚精子DNA,混勻后,100μL/管分裝於新的Eppendorf管中,每管加入以NotI消化后的質粒DNA0.5μg,徹底混勻后,於45℃,孵育30min。細胞經離心收集,懸浮於400μL的SC-ura,用200μL鋪板,於30℃,2d。
1.2.4LacZ基因的表達為檢測LacZ基因的表達,將克隆挑選出來,鋪片於YPAD平板中,每板的密度為100個鋪片。以無菌濾紙,將上述平板複製於另一SC-ura平板上,37℃過夜。將濾紙取出,克隆面朝上,置於一密閉容器中。容器底部加入10mL氯仿,10~30min。取出濾紙,克隆面朝上,置於X-gal平板(120gX-gal,0.1mol/LNaPO4(pH7),1mmol/LMgSO4,於1.6%瓊脂平板中),30℃,2d。查找X-gal陽性的克隆,從YPAD平板上重新挑取單克隆在SC-ura平板上,進行划板培養。將擴增的酵母菌種進行凍存保存(-80℃)。取LacZ表達最強的菌株進行大規模培養。
2.2LacZ基因的表達
若插入片段與酵母基因組讀碼框相匹配,LacZ基因編碼的β-半乳糖苷酶N端與宿主編碼的C端結合,產生生物活性與X-gal反應,生成藍色。
2.3酶切后的電泳圖
純化的質粒,經NotI酶解,應可見一條2.1kb左右的較均一的條帶(載體pHSS6)和較不均的DNA插入片段條帶(約8kb,含有mTn-3xHA/LacZ)。
(DystrophiaMuscularis簡稱dy)或稱肌失營養症即後肢癱瘓小鼠
該鼠與人類有相似的肌萎縮癥狀,其dy/dy大約出生兩星期可見後肢拖地,表現有進行性肌衰弱和廣泛性的肌萎縮。病鼠出生時是活的,但只有少數病鼠能存活10周以上,無繁殖力。但已證明dy/dy雌鼠的卵巢移植到正常雌鼠體內是具有生殖能力的。由於雌本基本不育。因交配無能,且母性不好,一般和留雜合型,如雄鼠與正常雌本交配有困難,可人工受精,也可卵巢移植。常用的有REJ129/dy後肢偏癱小鼠。
(Obese,簡稱ob)
實驗小鼠
這種小鼠的肥胖症與人類的肥胖症很相似。利用這種小鼠曾進行了許多有益於肥胖症的生化、病理、激素及藥物治療等的研究。因為這種鼠無生育力,所以必須用雜合子交配以保持此基因。Ob/+和+/+很難區別,表現完全一樣,用其交配要花費很長時間才能辨別。這種突變小鼠的維持很困難。若節制飲食使體重下降,則其維持種系的效果不好,亦可從肥胖鼠的卵巢取卵子移植於+/+鼠進行繁殖。除ob突變型外,後來又發現ad即成年肥胖和糖尿症(Adultobesityanddiabetes)。ad/ad型的肥胖症體重相當於正常鼠的兩倍,與ob/ob型一樣,通常不育,7-10周齡時表現出高血糖和糖尿症。在紐西蘭小鼠中也表現一種肥胖症叫NZO(NewZealandObese)。該鼠通常具有生殖能力,所有的小鼠均發生肥胖,但脂肪沉積主要是在腹內,於2~4月齡時即可發現脂肪沉積,最終達到總體重的70%,高血糖不明顯,但胰島素的水平升高。在快速增重期間,食物的攝入量明顯的增加。此外,還有一種肥胖Fatty,基因符號為fa,肥胖同時有糖尿病,受孕率低。日本KK小鼠也發生肥胖。從小鼠的肥胖症知道,肥胖症有不同的遺傳型。這對研究人類肥胖症的一系列問題頗有助益。
(DwarfMice,簡稱dw)或稱矮小畸形鼠
這種畸形又稱垂體性侏儒症(PituiaryDwarfism),因為其缺乏腦下垂體前葉的生長素和促甲狀腺激素,故使生長發育障礙。純合子dw/dw小鼠在12~13月齡時即可被識別,它表現為短尾和短鼻,到成熟年齡時,其體積約為同窩正常鼠的1/4,8周齡時體重為8~10克,儘管多數能存活到成熟期,但雄鼠和雌鼠均無生殖力,可出現繼發的粘液性水腫。給病鼠食入垂體前葉碎片可以使生長速度基本正常。由於該鼠無生育能力,兩性均不育,所以只能用雜合子把基因保留下來,這樣只能得到25%的矮小畸形鼠於,9月鼠齡時將正常垂體移植到這種鼠的腎臟,在雄鼠可長大到近於正常小鼠體形並可繁殖(但在雌鼠收不到效果,原因不明)。這種突變型小鼠在內分泌研究上有較大用處,如對“生長素”等進行分析研究等。
(Deabetes,簡稱db)
由Hummel等(1966)最先報導,它是由單隱性突變基因引起,自發於Jackson實驗室的近交系小鼠(C57BL/Ks),該基因(db)與肥胖(ob)不是等位基因,儘管它們的表現型特徵相似,db/db基因鼠的第一個表現是當病鼠到3~4周齡時,腋和腹股溝皮下組織出現脂肪的異常沉積,此時血糖升高,從200mg/100ml血以下的正常水平上升到一年齡時的682mg/100ml血(平均為563.2mg/100ml血)。雌鼠無生殖力,但其卵巢移植到其它鼠后仍能恢復生殖活性。多數鼠不能存在到8個月以上,但若在病的早期節制飲食則可延長其生命。臨床癥狀包括肥胖、高血糖、糖尿、蛋白尿、煩渴、多尿,最後可因酮尿而死亡。死後變化包括胰島細胞中具有很少β顛粒和胰管腫脹。Like(1972)描述了db/db小鼠腎小球的變化,在外形上與同齡正常小鼠的一樣,但比後者大得多,小鼠到了糖尿病發病年齡時,腎小球膜變化更加明顯,外周基層持續增厚,並生有許多小結,還認為多尿可能是高血糖對腎小球產生利尿作用的結果。
(Ostepetrosis,簡稱op)
實驗小鼠
由於病鼠骨質生長異常,骨質硬,骨髓腔消失,所有骨骼都硬化,並伴有無齒症。因此往往在同窩仔鼠中發現死亡仔鼠。第二窩才出現斷奶后死亡的小鼠無牙齒,系因不能吃食而死亡,但於斷奶后喂軟飼料可保留下來。op為隱性基因,無齒型發生於肥胖型父母,第二代出現無齒。正常時上下頜骨有牙齒的主要發點,骨硬化症時有生長牙齒的生髮點,但因骨質硬而不能長出。這種鼠的病變的與人類大理石骨病相似。
治療方法有:
1.聯體生活(Parbiosis):可使部分動物得到治療,一個月可治癒。
2.骨髓移植(BoneMarrowGrafts):對人類用此種方法。此病病因不明,病人造血機能發生變化。此種動物可用作研究人類骨髓硬化症的模型。
(DominantSpotting)因為斑的大小是指白斑(WhiteSpotting)大小,所以縮寫為W。正常時是小寫ww,當呈WW時則表現出貧血。在W處有五個等位基因,任何兩個等位基因都可引起嚴重的大紅細胞性、發育不全性貧血,同時引起肝臟造血功能障礙。貧血的嚴重性受環境和基因型影響。可出現不同類型的突變體,如W/+,Wv/+,Wv/Wv,W/Wv,W/WJ,WJ,WN等。這些突變體均無生育力,表現為黑眼,白色。
WW出生后只能存活幾天,當有修飾基因存在時,則Ww呈部分顯性,可出現90~98%白斑;如無修飾基因存在,則呈現純白,但為黑眼;如有一些修飾基因存在可出現不同程度的花斑。W是一組復等位基因,如Wv的v是Viable(活)的意思。WvWv可活到成年,為白色、黑眼,通常是不育的,偶然表現出有限的生育力,其紅細胞只有正常的半數,與人類貧血相似。
用於造血系統研究的突變小鼠有:
1.W突變(DominantSpotting)小鼠
⑴W/Wv:遺傳性貧血小鼠,能活到成年,如WBB6F1/J-W/Wv小鼠。
⑵+/+:非貧血小鼠,紅細胞計數正常,如WBB6F1/J-+/+小鼠。
⑶W/W:遺傳性貧血小鼠,造血幹細胞正常,是造血微環境發生缺陷的小鼠。
⑷W/Wa:遺傳性貧血小鼠,造血微環境正常,是造血幹細胞發生缺陷的小鼠。
2.an突變(Hentwig′sAnemia)小鼠。
大紅細胞性貧血,貧血嚴重程度隨遺傳背景不同而異,妊娠的第12天開始發生的造血功能缺陷,伴有白細胞減少症。
3.f突變(Flexed-Tail)小鼠:
高鐵紅細胞性貧血,貧血變化是由於胎兒肝臟造血障礙所致,因此出生時即發生貧血。此種小鼠,表現為尾彎曲。
5.ha(HemolyticAnemia)突變小鼠:新生期溶血性貧血,多於妊娠14天時出現。新生期黃疸,多數死於出生后的一周內。
6.Sph(Spherocytosis)突變小鼠:有溶血性貧血、球形紅細胞症、膽紅素過多血症,出生后短期內死亡。
7.Sla(Sex-LinkedAnemia)突變小鼠:表現為輕度貧血、網狀紅細胞症、骨髓缺乏。兩性生長均受阻,但能存活。
9.Ts(Tail-Short)突變小鼠:Ts/Ts小鼠常死於子宮中,到妊娠的第8天,表現為尾短且扭曲以及其他骨骼異常,生前貧血以及卵黃囊造血障礙,貧血還可導致其它異常。
(Catarct,簡稱Cat)
(Asplenia,簡稱As)
該鼠脾臟完全缺如,它作為一個遺傳性疾病出現於顯性半肢畸形的雜合子小鼠。這些小鼠已被廣泛應用於脾臟功能的研究,也是研究中醫中藥的重要動物模型,還是研究血吸蟲病的良好實驗材料。
(Grey-Lethal,簡稱Gl)
(ReinalDegeneration,簡稱rd)
此種病鼠與人類的色素性視網膜炎相似,人類的色素性視網膜炎也是一種遺傳病,呈現進行性視網膜硬化,有色素沉著及視網膜血管閉鎖萎縮。人類這種病例很難取得標本進行病理等研究,而動物模型則提供了極為理想的實驗材料,還可進行其它一系列研究。
(Dilte-Lethal,簡稱aL)
(Pintail,簡稱Pt)
(Hypodactyly,簡稱Hd)
該鼠兩前肢有足趾各2個,兩後肢有足趾各4個。雄鼠少趾症同時出現精子缺乏(OIigospermia)。雌鼠生育力正常。少趾與精子缺乏相關共存是一個有興趣的現象。裸鼠亦有類似情況。無毛時生育力低下,其中關係尚未搞清。可能與多型性(Pleomorphic)基因或伴性(Sexlinkage)基因相關。只見於小鼠和大鼠,原因不明。
(HypertensionRat)
SHR(SpoataneouslyHypertensiveRats)即自發性高血壓大鼠,是由Okamoto和Aoki選育成功的。正常大鼠收縮壓110-120mmHg,開始用♂145-175mmHg×♀130-140mmHg作為親代,以後兄妹交配。育成的高血壓大鼠出生后5周血壓可達150mmHg,而成年雄鼠的血壓達200mmHg,其特點是高血壓自發率為100%,血壓平均170-180mmHg,最高達200mmHg,並有高血壓性心血管病變。繁殖時每代都要選血壓高的動物(高於180mmHg)作為繁殖鼠種。
(AudiogenicSeizures聲源癲癇發作)
用鈴響聲刺激會旋轉起舞數秒鐘,然後一側倒地發作癲癇,與人類癲癇相似。可用此種鼠作動物模型來研究人類癲癇病。中國醫學科學院生理研究所和北醫均有飼料。