分子生物學實驗技術

作為一本實驗技術類專著，本書不僅較詳細地闡述了有關技術的具體操作和程序，更著力於對各種技術的基本原理及其相關理論基礎進行深層次的剖析。

故本書不僅可作為從事生命科學，特別是分子生物學相關領域工作者的實驗室必備參考工具書，同時也可供高校相關專業師生及科學工作者對分子生物學實驗技術的理論做深入探討時參考。

本書是關於分子生物學實驗技術的一部綜合性著作。它全面覆蓋了有關分子生物學實驗技術的諸多領域，包含了生物大分子製備和分析常用技術、蛋白質與核酸的提取與分離、PCR技術、分子雜交與印跡技術、分子克隆技術、外源基因轉移技術、蛋白質表達技術、分子標記技術、分子改造技術、測序及人工合成技術、基因組學技術、蛋白質組學技術、生物晶元技術、生物信息學技術、RNA研究技術等。

第一章 生物大分子製備和分析常用技術

第一節 概論

一、預處理和細胞的分離

（一）選擇材料及預處理

（二）細胞的分離

二、細胞的破碎及細胞器的分離

第二節 電泳技術

一、基本原理

二、影響電泳的因素

三、醋酸纖維素薄膜電泳

四、瓊脂糖凝膠電泳

（一）核酸分子大小與瓊脂糖濃度的關係

（二）核酸構型與瓊脂糖凝膠電泳分離的關係

（三）瓊脂糖凝膠電泳基本方法

五、常規聚丙烯醯胺凝膠電泳

（一）聚丙烯醯胺凝膠聚合原理及相關特性

（二）聚丙烯醯胺凝膠電泳原理

（三）操作方法

六、SDS?聚丙烯醯胺凝膠電泳原理

七、聚丙烯醯胺梯度凝膠電泳

八、聚丙烯醯胺凝膠等電聚焦電泳

（一）等電聚焦的原理

（二）pH梯度的形成

九、雙向凝膠電泳

十、染色方法

（一）蛋白質染色

（二）核酸染色

第三節 色譜技術

一、色譜技術的概念

二、色譜法的分類

（一）按兩相所處的狀態分類

（二）按色譜的分離機制分類

三、常用的色譜方法

（一）凝膠色譜

（二）離子交換色譜

（三）親和色譜

（四）高效液相色譜

（五）毛細管電泳

第四節 離心技術

一、離心理論

（一）離心分離的原理

（二）相對離心力和離心時間

（三）離心機的分類

二、離心分離的種類

（一）差速離心法

（二）密度梯度離心法

三、離心操作注意事項

第五節 分光光度技術

一、基本原理——朗伯？比爾定律

二、分光光度技術的應用

（一）定量分析

（二）定性分析

第二章 蛋白質、核酸的提取與分離

第一節 蛋白質的提取、分離純化及定量

一、蛋白質（包括酶）的提取

（一）水溶液提取法

（二）有機溶劑提取法

二、蛋白質的分離純化

（一）根據蛋白質溶解度不同進行分離的方法

（二）利用色譜技術對蛋白質進行分離純化

（三）利用電泳技術對蛋白質進行純化分離

（四）利用超速離心分離製備蛋白質

（五）膜分離技術在蛋白質分離純化中的應用

（六）重組蛋白的分離純化

（七）分離製備蛋白質的一個實例

三、蛋白質的定量

第二節 DNA的提取與分離

一、質粒DNA的提取與分離

（一）質粒提取的一般步驟

（二）質粒DNA的小量製備

（三）質粒DNA的大量製備

二、染色體DNA的提取與分離

(一)從培養細胞中提取DNA

(二)從組織中提取DNA

(三)從大量血樣的白細胞中分離高分子量DNA

(四)從小量血樣的白細胞中分離高分子量DNA

(五)高分子量DNA的小量快速製備

第三節 RNA的提取與分離

一、組織培養細胞胞質RNA的製備

二、胍鹽法製備總RNA

(一)氯化銫純化培養細胞的RNA

(二)氯化銫純化組織中的RNA

(三)一步法從培養細胞或組織中分離RNA

三、細菌RNA的製備

(一)從革蘭陰性菌中分離高質量RNA

(二)革蘭陽性菌RNA的分離

(三)革蘭陰性菌RNA的快速分離

四、poly(A)+RNA的製備

第四節 核酸的定量測定

一、紫外分光光度法測定DNA和RNA的含量

二、電泳比較法（溴化乙錠熒光法）

三、定磷法測定核酸

四、二苯胺法測定DNA含量

五、地衣酚法測定RNA含量

第三章PCR技術77

第一節PCR技術基礎77

一、基本原理77

（一）反應過程77

（二）產物類型78

（三）平台效應78

二、PCR技術的特點79

三、標準PCR反應79

四、影響因素80

(一)模板80

(二)引物81

(三)循環參數82

(四)Taq DNA聚合酶及其濃度83

(五)Mg2+濃度83

(六)dNTP濃度83

(七)其他輔助試劑84

五、擴增產物的檢測分析84

（一）瓊脂糖凝膠電泳84

（二）聚丙烯醯胺凝膠電泳85

（三）核酸探針雜交鑒定法85

（四）限制性內切酶分析法85

（五）單鏈構型多態性分析法86

六、PCR條件優化86

(一)常規的優化方法86

(二)降落PCR86

七、PCR常見問題與對策87

（一）PCR污染87

（二）污染的預防87

(三)實驗中的對照87

(四)擴增反應總是陰性結果(無產物)時應採取的措施87

(五)出現非特異性產物時應採取的措施88

第二節PCR技術的擴展88

一、逆轉錄PCR88

二、定量PCR89

（一）利用參照物的定量方法89

（二）競爭性定量PCR89

（三）熒光定量 PCR90

三、重組PCR91

四、反向PCR92

五、不對稱PCR92

六、複合PCR92

七、著色互補PCR 93

八、錨定PCR93

九、原位PCR93

十、膜結合PCR93

十一、固著PCR93

十二、增效PCR94

第三節PCR技術的應用94

一、PCR技術在分子生物學中的應用94

二、PCR技術在傳染病病原體檢測中的應用95

三、PCR在腫瘤相關基因檢測中的應用96

四、 PCR技術在遺傳病早期診斷中的應用97

五、PCR在骨髓移植HLAD位點配型中的應用98

六、 PCR技術在法醫學鑒定中的應用98

七、 PCR在進化分析中的應用99

第四章分子雜交與印跡技術100

第一節核酸雜交的基本理論100

一、 DNA變性、復性及雜交100

二、核酸探針101

三、核酸雜交方法102

（一）影響雜交的因素102

（二）固相雜交法103

(三)液相雜交法 104

（四）雜交信號的檢測107

第二節常用印跡雜交方法107

一、 Southern印跡雜交法107

二、 Northern印跡雜交法111

三、斑點及狹縫印跡雜交113

四、菌落原位雜交法 113

五、核酸原位雜交法115

（一）組織與細胞的固定115

（二）載片和組織切片的處理115

（三）雜交116

（四）雜交后處理118

（五）顯示119

（六）對照實驗和核酸原位雜交結果的判斷119

六、 Western印跡雜交法120

（一）蛋白質的分離120

（二）轉膜120

（三）鑒定用膜的準備121

（四）鑒定122

第五章分子克隆技術123

第一節概述123

一、分子克隆的基本步驟123

二、分子克隆研究的內容124

（一）分子克隆工具的研究124

（二）分子克隆技術的研究124

（三）克隆對象——目的基因的研究124

（四）分子克隆產品的研究124

第二節克隆操作中需要的工具酶125

一、限制性核酸內切酶125

（一）限制性核酸內切酶的類別126

（二）同工異源酶與同尾酶127

（三）限制性核酸內切酶活性及其影響因素128

二、 DNA連接酶128

三、 DNA聚合酶129

（一）DNA聚合酶Ⅰ129

（二）Klenow酶129

（三）Taq DNA聚合酶129

（四）逆轉錄酶130

（五）T4 DNA聚合酶130

（六）T7 DNA聚合酶131

四、修飾酶131

（一）鹼性磷酸酶131

（二）末端轉移酶132

（三）T4多核苷酸激酶132

（四）S1核酸酶132

第三節基因克隆載體133

一、質粒載體133

二、噬菌體載體135

三、黏粒載體137

第四節基因克隆的一般方法137

一、獲得目的基因的常用方法137

（一）化學合成法137

（二）逆轉錄PCR克隆目的基因138

（三）PCR方法克隆目的基因139

（四）利用基因表達差異的克隆方法139

二、目的基因與載體連接141

（一）具黏性末端的DNA片段之間的連接141

（二）平末端的連接142

三、構建文庫克隆目的基因143

（一）構建cDNA文庫克隆目的基因143

（二）構建基因組文庫克隆目的基因147

四、利用差異文庫的克隆方法150

（一）差別雜交和扣除雜交克隆的目的基因150

（二）代表性差別分析技術克隆目的基因151

（三）抑制性扣除雜交技術153

第五節克隆篩選與鑒定155

一、重組DNA導入受體細胞155

二、重組體的篩選與鑒定156

（一）根據遺傳表型的篩選方法156

(二)依賴重組子結構特徵的篩選法158

第六章外源基因轉移技術160

第一節外源基因導入原核細胞的常用方法160

一、自然條件下的轉化現象160

二、受體細胞的選擇161

三、轉化方法162

（一）CaCl2誘導大腸桿菌轉化法162

（二）電穿孔驅動的完整細胞轉化164

（三）PEG介導的細菌原生質體轉化164

（四）通過接合作用傳遞質粒DNA165

（五）λ噬菌體的轉導和轉染165

四、轉化率及其影響因素166

第二節外源基因導入真核細胞的方法167

一、物理方法168

二、化學方法170

三、生理方法174

第三節病毒載體介導的基因轉移175

一、RNA病毒載體及其介導的基因轉移175

（一）逆轉錄病毒175

（二）逆轉錄病毒載體176

二、DNA病毒載體及其介導的基因轉移179

(一)腺病毒載體179

(二)腺病毒相關病毒載體180

(三)皰疹病毒載體180

(四)嵌合(雜合)病毒載體181

第四節報告基因的應用181

一、報告基因及其應用範圍181

（一）報告基因181

（二）報告基因的應用182

二、常見的幾種報告基因及其應用183

（一）熒光素酶183

（二）綠色熒光蛋白184

(三)氯黴素乙醯轉移酶(CAT)187

（四）β半乳糖苷酶187

（五）分泌型的鹼性磷酸酶(SEAP)188

（六）人生長激素(hGH)188

（七）β葡糖醛酸酶(GUS)189

第七章蛋白質表達技術190

第一節外源基因在原核細胞中的表達190

一、大腸桿菌表達系統190

（一）大腸桿菌表達載體的表達元件190

（二）大腸桿菌的表達載體194

（三）外源基因在大腸桿菌中表達197

（四）提高外源基因表達水平的措施199

（五）包含體200

二、芽孢桿菌表達系統201

（一）芽孢桿菌基因表達的特點201

（二）芽孢桿菌表達系統202

（三）存在的問題203

三、鏈黴菌表達系統204

（一）鏈黴菌的生物學特徵204

（二）鏈黴菌基因表達的特點205

（三）鏈黴菌基因表達系統206

（四）影響鏈黴菌中基因表達的因素208

（五）鏈黴菌表達系統的優缺點209

第二節外源基因在真核細胞中的表達209

一、酵母表達系統209

（一）酵母表達系統的組成210

（二）酵母表達系統的應用策略213

二、昆蟲表達系統216

（一）桿狀病毒表達系統216

（二）家蠶核型多角體病毒（BmNPV）表達系統220

第三節哺乳動物細胞表達系統220

一、哺乳動物細胞表達系統的構成221

（一）宿主細胞221

（二）表達載體222

（三）目的基因225

二、常用的細胞表達系統225

三、基因的導入方法226

四、外源基因在哺乳細胞的表達和基因表達產物的檢測226

五、哺乳動物細胞表達系統的改進策略226

（一）改進表達載體，提高表達水平226

（二）改造宿主細胞及培養手段228

（三）提高產品質量229

（四）篩選高表達細胞克隆的新方法230

第四節重組蛋白的檢測與鑒定230

一、定量分析230

二、純度分析230

三、重組蛋白質的鑒定231

第八章分子標記技術233

第一節概述233

一、放射性同位素233

（一）放射性同位素的基本性質233

（二）放射性強度及其度量單位234

（三）射線與物質的相互作用234

（四）射線的防護234

二、放射性同位素標記235

三、非同位素標記236

（一）發光信號的特點236

（二）化學發光的本質237

（三）生物發光237

（四）熒光的基礎237

第二節核酸的標記238

一、放射性同位素標記探針238

（一）切口平移法238

（二）末端標記法240

（三）隨機引物法標記DNA片段243

（四）聚合酶鏈反應標記高活性DNA探針244

二、非放射性同位素標記244

（一）間接非同位素標記245

（二）用生物素、地高辛或熒光素標記探針的方法245

（三）DIG標記實例248

（四）直接非同位素標記249

第三節蛋白質的標記250

一、熒游標記250

（一）利用氨基的標記方法250

（二）利用巰基的標記方法252

（三）利用醇羥基的標記方法253

二、利用酶、酶的底物及酶抑製劑的標記253

（一）糖苷酶及其底物254

（二）磷酸酶類及其底物254

（三）其他酶與底物255

（四）生物素與親和素系統255

三、利用抗體的標記技術256

（一）免疫熒游標記技術256

（二）放射免疫標記技術257

（三）酶免疫標記技術258

（四）膠體金標記技術258

（五）發光免疫標記技術259

第九章分子改造技術261

第一節概述261

第二節蛋白質的體外改造262

一、寡核苷酸指導的誘變方法262

（一）非PCR的誘變方法263

（二）PCR方法 263

（三）誘變寡核苷酸的設計265

二、隨機誘變266

（一）化學誘變266

（二）丙氨酸掃描誘變267

三、突變體篩選方法267

（一）限制酶切割區分親本模板與突變產物268

（二）單一限制位點的消除268

四、分子進化268

（一）概念268

（二）基本方法269

第三節蛋白質改造技術的應用271

一、點突變271

二、結構域改組271

三、全蛋白的重組272

四、蛋白質配體相互作用272

第四節單克隆抗體的改造273

一、抗體的產生和抗體的結構274

二、多抗、單抗及重組抗體275

三、抗體改造276

（一）人鼠嵌合抗體276

（二）小分子抗體277

（三）雙功能抗體277

（四）抗體融合蛋白278

第十章測序及人工合成技術279

第一節DNA序列測定279

一、Sanger雙脫氧鏈終止法279

（一）Sanger雙脫氧鏈終止法的原理279

（二）Sanger雙脫氧鏈終止法所需關鍵試劑280

（三）用於測序的變性凝膠電泳282

（四）大片段DNA的測序策略282

二、MaxamGilbert化學修飾法283

（一）化學裂解法測序的原理283

（二）化學試劑特異斷裂DNA的機制284

三、DNA序列的自動測序284

第二節DNA的化學合成285

一、DNA化學合成的原理286

（一）磷酸三酯法合成寡核苷酸的原理286

（二）固相亞磷酸三酯法合成寡核苷酸的原理286

（三）用寡核苷酸片段組裝基因的方式288

二、DNA合成技術在分子生物學研究中的應用289

第三節蛋白質和多肽的氨基酸序列測定291

一、序列測定前的準備291

（一）蛋白質純化291

（二）肽鏈的分離292

（三）肽鏈的部分裂解292

（四）肽片段的分離293

二、序列測定的方法和原理294

（一）手工測序294

（二）自動序列分析297

三、影響測序的因素298

第四節蛋白質或多肽的化學合成298

一、氨基酸官能團的保護299

二、羧基的活化和肽鍵的生成301

三、合成肽的脫保護基及純化302

第十一章基因組學技術305

第一節結構基因組學及常用研究技術305

一、基因組作圖305

二、新基因的分離——cDNA末端快速擴增（RACE）技術307

三、基因組序列測定技術310

四、基因定位技術311

（一）熒光原位雜交（FISH）技術311

（二）輻射雜種細胞系（RH）技術312

第二節功能基因組學及常用研究技術312

一、基因突變檢測（分析）技術313

（一）單鏈構象多態性（SSCP）技術313

（二）變性梯度凝膠電泳（DGGE）技術315

（三）直接測序法317

（四）單鹼基延伸標籤陣列技術( SBETAGS)318

（五）異源雙鏈分析技術318

（六）連接酶鏈反應318

（七）等位基因特異性寡核苷酸雜交（ASOH）318

（八）RNA酶A切割法319

（九）基於PCR與酶切的技術319

（十）高通量檢測技術320

二、比較基因組雜交技術321

三、微陣列比較基因組雜交技術323

四、染色體原位雜交325

五、基因表達分析技術325

（一）基因表達系列分析技術（SAGE）326

(二)RNase保護試驗(RPA)328

六、模式生物體研究328

（一）轉基因動物329

（二）基因打靶技術334

（三）時空可調節性基因打靶技術337

（四）基因陷阱338

（五）誘變技術在功能基因組學中的應用341

七、SNP、EST在研究新（未知）基因中的應用341

（一）單核苷酸多態性（SNP）341

（二）表達序列標籤(EST)343

第十二章蛋白質組學技術345

第一節概述345

一、蛋白質組學研究的意義和背景345

二、蛋白質組學研究的特點346

第二節蛋白質組學研究的技術體系與路線350

一、蛋白質組分離技術350

（一）雙向凝膠電泳的特點350

（二）雙向凝膠電泳的基本步驟351

（三）蛋白質組分離的非凝膠技術356

二、蛋白質組分析技術358

三、蛋白質組資料庫的建立和生物信息學359

四、蛋白質組研究的發展趨勢及應用前景359

第三節蛋白質組學技術平台與完整解決方案360

一、蛋白質組學技術平台360

二、蛋白質組學研究的完整解決方案361

第十三章生物晶元技術364

第一節概述364

一、生物晶元的概念和特點364

二、生物晶元的分類365

第二節基因晶元366

一、基本原理366

二、基因晶元的製備和檢測366

（一）晶元載體的表面修飾366

（二）晶元陣列製作方式367

（三）雜交探針的種類與製備368

（四）樣品製備和標記370

（五）雜交370

（六）雜交信號採集和處理371

（七）生物信息的分析和提取371

第三節蛋白質晶元373

一、基本原理374

二、蛋白質晶元製備和檢測的基本流程377

（一）蛋白質晶元製備與檢測流程377

（二）待檢樣品的製備和標記379

（三）蛋白質晶元的雜交反應和結果檢測380

三、蛋白質晶元的研究進展381

（一）方法學研究和新技術的應用381

（二）抗體晶元382

第四節生物晶元在醫學中的應用382

一、基因晶元在醫學中的應用382

（一）微縮實驗室晶元382

（二）基因突變分析383

（三）克隆選擇及文庫篩選383

（四）測序晶元384

（五）基因多態性分析384

（六）基因表達譜分析384

（七）微生物菌種鑒定、致病機理及耐藥性分析385

（八）藥物篩選晶元385

二、蛋白質晶元在醫學中的應用385

（一）蛋白質組基因組鏈接385

（二）高通量的蛋白質表達篩選及藥物研究386

（三）蛋白質和蛋白質之間相互作用的研究386

（四）在疾病診斷方面的應用388

（五）展望388

第十四章生物信息學技術390

第一節概述390

一、生物信息學的誕生和發展390

二、生物信息學研究的基本方法390

三、生物信息學的目的意義391

第二節常用核酸序列資料庫392

第三節常用蛋白質序列資料庫398

第四節序列分析402

一、序列比對方法和相似性搜索403

二、FASTA404

三、BLAST405

第五節蛋白質結構預測410

一、二級結構和摺疊類型410

二、三級結構預測411

第十五章RNA研究技術414

第一節RNA結構分析和合成分析414

一、用單鏈DNA探針和S1核酸酶分析mRNA414

二、核糖核酸酶保護測定419

三、引物延伸法422

四、RNA runon分析424

第二節RNA組學技術425

一、反義核酸技術426

（一）反義RNA作用機制426

（二）反義RNA 技術方法427

（三）反義RNA技術應用428

二、RNA干擾（RNAi）技術428

（一）RNAi作用的機制429

（二）RNAi實驗方案430

（三）RNAi敏感性的預測432

（四）siRNA導入宿主細胞433

（五）結果分析434

（六）RNAi在基因功能分析中的應用434

第三節核酶技術434

第四節RNA錯摺疊（ODMiR）技術436

附錄438

參考文獻451